Basic operation of Western blotting

MSDS

1. 개요

Western blotting은 단백질 시료 중에 포함된 특정 단백질의 발현량을 확인하기 위해 사용되는 일반적인 방법입니다. 실험의 조작과 원리는 간단하지만, 원하는 결과를 얻는 것이 쉽지는 않습니다. 여기에서는 ATTO의 제품을 사용하여 Western blotting의 기본 조작에 관해 소개하겠습니다.

2. 실험 과정

1. 샘플 조제
세포, 조직이나 미생물 등에서 RIPA Lysis buffer나 SDS sample buffer를 이용하여 단백질을 추출하여 SDS처리 및 환원 처리를 합니다.
* 사용하는 제품 (Fractionation / Extraction Kit, Sample preparation solution)
AE-1430 EzApply, WSE-7010 EzLabel FluoroNeo, WSE-7420 EzRIPA Lysis kit, etc.
* 사용하는 제품 (Block incubator)
WSC-2615 MyMiniBLOCK C&H, etc.

2. 전기영동
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis로 단백질을 분리합니다. 목적하는 단백질에 따라 acrylamide의 농도를 바꿔줍니다. 목적하는 단백질의 분자량이 불분명한 경우, gradient gel을 사용합니다.
* 사용하는 제품 (Gel, Running buffer)
e-PAGEL, AE-1410 EzRun, etc.
* 사용하는 제품 (전기영동장치, Power supply)
WSE-1165 Mini-Slab, WSE-3400 myPower H300, etc.

3. Transfer
전기영동으로 분리된 단백질을 gel에서 PVDF membrane으로 이동시킵니다.
* 사용하는 제품 (Transfer buffer)
AE-1465 EzFastBlot, WSE-7210 EzFastBlot HMW, etc.
* 사용하는 제품 (Blotter, Power supply)
WSE-4125 PoweredBLOT 2M, etc.

4. Blocking
단백질 밴드가 없는 membrane 표면에 항체가 비특이적으로 결합하지 않도록 차단합니다.
* 사용하는 제품 (Blocking solution)
AE-1475 EzBlock Chemi, etc.
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

5. 항체 반응
Target protein에 대한 항체 (1차 항체) 및 HRP 등 효소로 표지된 항체 (2차 항체)와 반응합니다.
* 사용하는 제품 (항체 희석 및 Wash buffer)
WSE-7230 EzTBS, WSE-7235 EzTween, etc.
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

6. Detection
2차 항체에 표지된 효소와 반응하여 발색 또는 발광하는 기질을 이용하여 target protein 밴드를 간접적으로 검출합니다.
* 사용하는 제품 (발광/발색 시약)
WSE-7120 EzWestLumi plus, etc.
* 사용하는 제품 (Chemiluminescence imaging system)
WSE-6370 LuminoGraph III Lite, etc.

7. Stripping
Membrane에 결합한 항체를 떼어내고, 동일한 blotting membrane에서 다른 target protein을 검출할 수 있도록 합니다.
* 사용하는 제품 (Stripping solution)
WSE-7240 EzReprobe
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

3. 실험 방법

기기 · 시약 · 재료

세포, 조직 샘플 등 (ex. Hela cell)
단백질 추출 · 처리액 (AE-1430 EzApply, WSE-7010 EzLabel FluoroNeo, WSE-7420 EzRIPA Lysis kit, etc.)
Precast gel (e-PAGEL, etc.)
Running buffer (AE-1410 EzRun, WSE-7065 EzRun MOPS, etc.)
PVDF membrane (WSE-4050~4053 ClearBlot P plus Membrane)
Filter paper (Absorbent paper series)
Wash buffer (WSE-7230 EzTBS)
Detergent for wash buffer (WSE-7235 EzTween)
Transfer buffer (AE-1465 EzFastBlot, WSE-7210 EzFastBlot HMW, etc.)
Blocking solution (AE-1475 EzBlock Chemi)
Luminol substrate for HRP detection (WSE-7120 EzWestLumi plus, etc.)
Block incubator (WSC-2615 MyMiniBLOCK C&H, etc.)
전기영동장치 (WSE-1165 Mini-Slab, etc.)
Power supply (WSE-3100 PowerStation Ghibli I, WSE-3400 MyPower H300, etc.)
Blotter (WSE-4020 HorizeBLOT 2M, WSE-4125 PoweredBLOT 2M, etc.)
Chemiluminescence imaging system (WSE-6370 LuminoGraph III Lite, etc.)
Primary antibody (ex. Anti-transferrin rabbit antibody)
Secondary antibody (ex. HRP labeled anti-rabbit IgG angibody)
Tweesers, tray (Gel보다 약간 큰 것)
Shaker (WSC-2400 SeesawShaker atto)

3-1. Sample preparation

1. 50 μL의 샘플에 50 μL의 AE-1430 EzApply (2× conc. DTT 첨가완료)를 첨가합니다.

2. WSC-2615 MyMiniBLOCK C&H로 95℃에서 5분간 가열합니다. (Boiling 가능)

3. 15,000 rpm으로 5분간 centrifuge하여 (하지 않아도 무관) 상등액을 회수합니다.

3-2. Electrophoresis

1. e-PAGEL을 WSE-1165 Mini-Slab 전기영동장치에 세팅합니다.

2. 5~10 μL/lane의 샘플을 loading합니다.
* 샘플 농도는 purified protein은 100 ng~1 μg/lane, 추출액으로는 1~50 μg/lane이 적당합니다.

3. Power supply에 연결하여 전기영동을 시작합니다.
* 20 mA/gel로 약 80분간 전기영동합니다.

3-3. Transfer

1. 미리 PVDF membrane을 methanol로 hydrophilization처리한 후 (약 5초) (NC membrane의 경우 이 과정은 불필요함), 1× AE-1465 EzFastBlot에 침지해둡니다(5분 이상 완전히 담가둡니다).

2. 전기영동 후의 gel을 1× AE-1465 EzFastBlot으로 가볍게 washing하고 아래 그림과 같이 하부판 (Anode)에 Absorbent paper 2매, Membrane, gel, Absorbent paper 2매 순으로 포개어 놓습니다. Absorbent paper는 쌓기 전에 1× AE-1465 EzFastBlot에 담가둡니다.
* 전용 Roller를 사용하여 bubble을 제거하고, paper, gel, membrane을 밀착시킵니다.

3. Power supply에 연결하고, 25 V로 15분간 transfer합니다.

Transfer 세팅 방법 및 조작법 동영상입니다. 함께 참고해주세요!

ATTO의 transfer buffer 종류

Transfer buffer	AE-1460 EzBlot	AE-1465 EzFastBlot	WSE-7210 EzFastBlot HMW	WSE-7055 EzRun TG (Towbin method)
Major components	3액계 Solution A: Tris Solution B: Tris Solution C: Tris, 6-aminocaproic acid A~C: +Methanol (5%)	1액계 Tris, amino acids (No methanol)	1액계 Tris (No methanol)	1액계 25 mM Tris, 192 mM Glycine final conc. ~10%까지 Methanol 첨가 가능
Transfer 가능한 분자량	~300 kDa	~150 kDa	~500 kDa	~200 kDa
Transfer 조건	2 mA/cm² 60 min	20~25 V C.V. 5~15 min	20~25 V C.V. 15~30 min	2 mA/cm² 60 min
Preparation	Methanol 첨가하여 사용	DW로 10배 희석	DW로 5배 희석	DW로 10배 희석
특징	광범위한 분자량을 깨끗하게 트랜스퍼	약 10분 만에 150 kDa이하 단백질을 고효율로 트랜스퍼	30분 이내에 500 kDa의 고분자까지 효율적으로 트랜스퍼	주로 Wet blotting에서 사용 (Semi-dry 방식에서는 효율이 낮음)

* Methanol 첨가 시 membrane에 단백질 결합효율을 높일 수 있으나, gel의 단백질 transfer 효율이 저하되므로 주의하시기 바랍니다. PVDF membrane <15%, NC membrane <20%로 사용합니다.
* 고분자 단백질의 경우 0.01~0.05%의 SDS를 첨가하면 트랜스퍼 효율이 높아질 수 있습니다.
* Transfer 전에 전기영동 후의 gel을 transfer buffer로 15~30분간 equilibration하면 transfer 효율이 높아질 수 있습니다. 단, 단백질이 확산되거나 저분자 단백질이 소실될 수 있으니 주의바랍니다.
* Transfer pack 제품인 “QBlot kit“는 filter paper와 membrane 준비가 불필요합니다(Ready-to-Use). 전용 blotting buffer를 사용하여 transfer 효율도 높고, 단시간에 고효율 Western blotting이 가능합니다.
* Blotting이 완료된 membrane은 WSE-7160 EzStainAQua MEM으로 staining하면 band를 확인할 수 있습니다. Destaining 후에는 항원항체반응이 가능합니다.

3-4. Blocking

Transfer 후의 membrane을 blocking solution에 침지하여 실온에서 30분간 shaking하면서 incubation합니다. Mini gel 1장당 blocking solution은 50 mL 준비합니다.

ATTO의 blocking solution 종류

Blocking solution	Skim milk	AE-1475 EzBlock Chemi	AE-1476 EzBlock BSA	AE-1477 EzBlock CAS
Major components	Bovine skim milk	Synthetic polymer	Bovine albumin	Bovine casein
Reaction time	30~60 min	5~60 min	15~60 min	15~60 min
Avidin-biotin	×	○	○	×
Phosphorylated protein	×	○	○	×

* Skim milk는 3% 전후의 농도로 TBS-T에 희석하여 사용합니다.
* WSE-7240 EzReprobe를 사용할 경우, AE-1477 EzBlock CAS의 사용을 권장합니다.

3-5. Antibody reaction

1. Primary antibody를 0.1% Tween이 함유된 1× WSE-7230 EzTBS (TBS-T) 또는 1× WSE-7430 EzPBS로 희석합니다. (10 mL/gel)
* 항체의 희석배율은 항체에 따라 다릅니다. 각 항체에 첨부된 제조사의 사용설명서를 참고하여 주십시오. 일반적으로는 수백~수천배로 희석합니다.

2. Membrane보다 약간 큰 용기에 1.의 antibody solution을 넣어 실온에서 1시간 동안 shaking하면서 membrane과 incubation합니다.
* 항체의 반응 시간과 온도는 항체에 따라 다릅니다. 각 항체에 첨부된 제조사의 사용설명서를 참고하여 주십시오. 일반적으로는 실온 및 37℃에서 30~60 min 또는 4℃에서 overnight 반응합니다.

3. Antibody solution을 폐기하고 0.1% Tween이 함유된 1× WSE-7230 EzTBS (TBS-T) 또는 1× WSE-7430 EzPBS를 50 mL 첨가하여 5분간 shaking하며 incubation합니다. (Washing 과정) Washing 과정은 3회 이상 반복하여 실시합니다.

4. HRP-labeled secondary antibody를 0.1% Tween이 함유된 1× WSE-7230 EzTBS (TBS-T) 또는 1× WSE-7430 EzPBS로 희석합니다. (10 mL/gel)
* 항체의 희석배율은 항체에 따라 다릅니다. 각 항체에 첨부된 제조사의 사용설명서를 참고하여 주십시오. 일반적으로는 수천~수만배로 희석합니다.
* Background가 높은 경우에는 antibody의 dilution factor를 높이거나, 항체 희석용액 (TBS-T 또는 PBS-T)에 blocking reagent를 blocking 시 사용량의 1/10 정도 첨가하면 경감됩니다.

5. Washing이 끝난 membrane에 4.의 antibody solution을 첨가하여 실온에서 30분간 shaking하면서 incubation합니다.
* 항체의 반응 시간과 온도는 항체에 따라 다릅니다. 각 항체에 첨부된 제조사의 사용설명서를 참고하여 주십시오. 일반적으로는 실온에서 30~60 min 또는 4℃에서 overnight 반응합니다.

6. Antibody solution을 폐기하고 0.1% Tween이 함유된 1× WSE-7230 EzTBS (TBS-T) 또는 1× WSE-7430 EzPBS를 50 mL 첨가하여 5분간 shaking하며 incubation합니다. (Washing 과정) Washing 과정은 3회 이상 반복하여 실시합니다.
* 과도한 Washing 과정을 수행하면 signal이 약해질 수 있습니다.

3-6. Detection

1. 검출방법 및 목적하는 검출 감도에 맞게 HRP detection 시약을 선택합니다. (아래 표 참조)

2. Membrane을 HRP detection 시약에 침지시켜서 반응합니다.

	WSE-7140 EzWestBlue W	WSE-7110 EzWestLumiOne	WSE-7120 EzWestLumi plus
검출 방법	TMB에 의한 발색	Luminol에 의한 발광	Luminol에 의한 발광
사용 방법	Membrane을 용액에 침지시켜 10~30분 반응	Membrane을 용액에 침지 후 즉시 검출	Membrane을 용액에 침지 후 즉시 검출
검출 감도	pico grade	low-pico grade	mid-femto grade
검출 지속시간	- (발색 후 유지)	1시간 <	3시간 <

* WSE-7140 EzWestBlue W를 사용할 경우, membrane과 10~30분간 차광하여 반응한 후, 스캐너 등으로 스캔하여 데이터를 기록합니다.
* WSE-7110 EzWestLumiOne은 membrane을 침지시킨 후, 즉시 Chemiluminescence imaging system으로 촬영하여 데이터를 기록합니다.
* WSE-7120 EzWestLumi plus는 Reagent A와 Reagent B를 1:1 동량으로 혼합하여 membrane을 침지시킨 후 즉시 Chemiluminescence imaging system으로 촬영하여 데이터를 기록합니다.
* Detection reagent의 샤용량은 100~200 μL/cm²입니다. Mini gel size의 경우 5 mL 이상 준비해주십시오.

3-7. Stripping

1. Detection후의 blotting membrane은 0.1% Tween이 함유된 1× WSE-7230 EzTBS (TBS-T) 또는 1× WSE-7430 EzPBS에 헹군 후, stripping을 하기 전까지는 TBS-T에 담가서 냉장 보관하십시오.

2. 100 mL의 WSE-7240 EzReprobe에 0.6 g의 Enhancer를 첨가하여 용해합니다.

3. Membrane을 WSE-7240 EzReprobe에 담그고 실온에서 5~15분간 shaking하며 incubation합니다.
* 항원의 양이 많은 경우나 항체의 titer값이 높은 경우에는 반응시간을 연장하거나 반응온도를 올리면 strippng 효율이 향상됩니다.

4. WSE-7240 EzReprobe를 폐기하고 TBS-T 또는 PBS-T를 ~10 mL 첨가하여 용기내벽과 membrane을 가볍게 헹굽니다.

5. 약 30 mL의 TBS-T 또는 PBS-T를 첨가하여 3분 동안 shaking합니다.

6. Membrane을 AE-1477 EzBlock CAS 등의 blocking solution을 처리합니다.

7. 새로운 primary antibody, secondary antibody를 순차적으로 반응시킵니다.

Related Products

QBlot kit C/M/W

Hydrophilization, equilibration이 완료된 PVDF membrane과 pad (filter paper 기능)이 세트로 구성된 semi-dry blotting용 transfer pack입니다. Bottom stack을 뜯어서 올리고 전기영동한 gel을 올린 후, Top stack을 뜯어서 올리면 바로 blotting이 가능합니다. 최단 5~10분 transfer가 가능합니다. 타사 semi-dry blotter에도 사용이 가능합니다. (호환 가능 모델은 문의주십시오.)

Transfer 분자량 범위: ~250 kDa
보존기간: 제조일로부터 1년 (냉장)
용량: WSE-4056/4057 10 stacks/box, WSE-4058 6 stacks/box

WSE-4056 QBlot kit C 구성품:
Top/Bottom Stack：65×65mm　각 10 pk
Gel Wash Buffer (5×): 100mL

WSE-4057 QBlot kit M:
Top/Bottom Stack：90×85mm　각 10 pk
Gel Wash Buffer (5×): 100mL

WSE-4058 QBlot kit W:
Top/Bottom Stack：135×85mm　각 6 pk
Gel Wash Buffer (5×): 100mL