Western blotting (Transfer)

MSDS

1. 개요

Western blotting의 트랜스퍼 (blotting)는 gel 안에서 분리된 단백질을 전기적으로 gel에서 끌어내어 membrane으로 옮기는 공정입니다. 말하자면 전기영동 gel의 복사본을 만드는 것과 비슷한 느낌입니다. 작업 자체는 간단합니다만, membrane에 transfer 할 때에 얼룩이 있거나 (Gel과 membrane이 밀착하지 않은 경우), 공기가 들어가 일부 부분이 transfer가 안되거나 할 수가 있어서 만족할 수 있는 blotting membrane을 얻는 것은, 숙련된 연구자도 꽤 어렵다고 합니다.
이번에는 ATTO의 제품을 사용하여 Western blotting의 Semi-dry blotting에 관해 소개하겠습니다.

2. 실험 과정

1. 샘플 조제
세포, 조직이나 미생물 등에서 RIPA Lysis buffer나 SDS sample buffer를 이용하여 단백질을 추출하여 SDS처리 및 환원 처리를 합니다.
* 사용하는 제품 (Fractionation / Extraction Kit, Sample preparation solution)
AE-1430 EzApply, WSE-7010 EzLabel FluoroNeo, WSE-7420 EzRIPA Lysis kit, etc.
* 사용하는 제품 (Block incubator)
WSC-2615 MyMiniBLOCK C&H, etc.

2. 전기영동
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis로 단백질을 분리합니다. 목적하는 단백질이 gel의 중앙에 올 수 있도록 acrylamide의 농도를 선택합니다. 목적하는 단백질의 분자량이 불분명한 경우, gradient gel을 사용합니다. 또한 blotting 효율을 판단하기 용이하도록 prestained protein marker 등을 사용합니다. 발현량을 비교할 경우에는 control sample을 함께 전기영동합니다.
* 사용하는 제품 (Gel, running buffer)
e-PAGEL, AE-1410 EzRun, etc.
* 사용하는 제품 (전기영동장치, power supply)
WSE-1165 Mini-Slab, WSE-3400 myPower H300, etc.

3. Transfer
전기영동으로 분리된 단백질을 gel에서 PVDF membrane으로 이동시킵니다.
* 사용하는 제품 (Transfer buffer)
AE-1465 EzFastBlot, WSE-7210 EzFastBlot HMW, etc.
* 사용하는 제품 (Blotter, Power supply)
WSE-4125 PoweredBLOT 2M, etc.

4. Blocking
단백질 밴드가 없는 membrane 표면에 항체가 비특이적으로 결합하지 않도록 차단합니다.
* 사용하는 제품 (Blocking solution)
AE-1475 EzBlock Chemi, etc.
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

5. 항체 반응
Target protein에 대한 항체 (1차 항체) 및 HRP 등 효소로 표지된 항체 (2차 항체)와 반응합니다.
* 사용하는 제품 (항체 희석 및 Wash buffer)
WSE-7230 EzTBS, WSE-7235 EzTween, etc.
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

6. Detection
2차 항체에 표지된 효소와 반응하여 발색 또는 발광하는 기질을 이용하여 target protein 밴드를 간접적으로 검출합니다.
* 사용하는 제품 (발광/발색 시약)
WSE-7120 EzWestLumi plus, etc.
* 사용하는 제품 (Chemiluminescence imaging system)
WSE-6370 LuminoGraph III Lite, etc.

6. Stripping
Membrane에 결합한 항체를 떼어내고, 동일한 blotting membrane에서 다른 target protein을 검출할 수 있도록 합니다.
* 사용하는 제품 (Stripping solution)
WSE-7240 EzReprobe
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

3. 실험 방법

3-1. Electrophoresis

목적 단백질이 중앙 부분에 오도록 gel의 acrylamide 농도를 선택합니다. Isoform이나 인산화 등 미세한 차이의 이동도를 가진 여러 단백질 밴드를 검출할 때에는 각각의 단백질을 분리할 수 있는 acrylamide 농도 혹은 gradient gel 등을 사용합니다. Gel의 acrylamide 농도가 낮을 경우 전기영동 후 gel이 쉽게 찢어질 수 있어서 blotting 조작 시에 취급이 어렵습니다. 또한 gel의 acrylamide 농도가 높을 경우에는 조작은 쉽지만 transfer 효율이 떨어집니다. 특히 13% 이상의 gel을 사용할 때에는 transfer buffer에 methanol이 포함되면 transfer 효율이 떨어지므로 methanol 농도를 낮추거나 넣지 않도록 합니다.

고분자의 경우	저분자의 경우
가능한 한 낮은 농도의 acrylamide를 사용합니다. 단, 7.5% 이하의 acrylamide gel은 취급이 어려우므로 gradient gel을 사용합니다. 150 kDa 이상의 고분자는 transfer 효율이 현저히 나빠지므로 고분자 전용 transfer buffer인 WSE-7210 EzFastBlot HMW를 이용하여 Semi-dry blotting을 하거나 Wet blotting을 합니다. 또한 transfer 전에 gel을 transfer buffer로 equilibrium (약 30분간)을 하면 단백질의 transfer 효율이 높아질 수 있습니다. 단, equilibrium 시간이 길어지면 저분자 단백질 밴드가 gel에서 빠져나가거나 밴드가 diffusion되므로 주의가 필요합니다.	일반적으로는 고농도의 acrylamide gel을 사용하지만 이 경우, transfer 효율이 현저히 떨어집니다. 그래서 10% 내외의 acrylamide gel과 저분자밴드가 잘 분리될 수 있는 running buffer, WSE-7065 EzRun MOPS를 사용하여 단백질을 분리합니다. 이 경우, acrylamide 농도가 균일하므로 gel의 변형을 줄일 수 있고, 10% 내외의 gel을 사용하여 고효율 transfer가 가능합니다.

고분자의 경우

저분자의 경우

가능한 한 낮은 농도의 acrylamide를 사용합니다. 단, 7.5% 이하의 acrylamide gel은 취급이 어려우므로 gradient gel을 사용합니다. 150 kDa 이상의 고분자는 transfer 효율이 현저히 나빠지므로 고분자 전용 transfer buffer인 WSE-7210 EzFastBlot HMW를 이용하여 Semi-dry blotting을 하거나 Wet blotting을 합니다. 또한 transfer 전에 gel을 transfer buffer로 equilibrium (약 30분간)을 하면 단백질의 transfer 효율이 높아질 수 있습니다. 단, equilibrium 시간이 길어지면 저분자 단백질 밴드가 gel에서 빠져나가거나 밴드가 diffusion되므로 주의가 필요합니다.

일반적으로는 고농도의 acrylamide gel을 사용하지만 이 경우, transfer 효율이 현저히 떨어집니다. 그래서 10% 내외의 acrylamide gel과 저분자밴드가 잘 분리될 수 있는 running buffer, WSE-7065 EzRun MOPS를 사용하여 단백질을 분리합니다. 이 경우, acrylamide 농도가 균일하므로 gel의 변형을 줄일 수 있고, 10% 내외의 gel을 사용하여 고효율 transfer가 가능합니다.

3-2. Transfer의 준비

전기영동을 하는 동안 트랜스퍼 준비를 합니다.

Transfer buffers
Mini gel size 1장당 200mL 준비합니다. 아래 표를 참고하여 목적 단백질의 분자량, transfer 시간 등을 고려하여 blotting buffer를 선택합니다.

Transfer buffer	AE-1460 EzBlot	AE-1465 EzFastBlot	WSE-7210 EzFastBlot HMW	WSE-7055 EzRun TG (Towbin method)
Major components	3액계 Solution A: Tris Solution B: Tris Solution C: Tris, 6-aminocaproic acid A~C: +Methanol (5%)	1액계 Tris, amino acids (No methanol)	1액계 Tris (No methanol)	1액계 25 mM Tris, 192 mM Glycine final conc. ~10%까지 Methanol 첨가 가능
Transfer 가능한 분자량	~300 kDa	~150 kDa	~500 kDa	~200 kDa
Transfer 조건	2 mA/cm² 60 min	20~25 V C.V. 5~15 min	20~25 V C.V. 15~30 min	2 mA/cm² 60 min
Preparation	Methanol 첨가하여 사용	DW로 10배 희석	DW로 5배 희석	DW로 10배 희석
특징	광범위한 분자량을 깨끗하게 트랜스퍼	약 10분 만에 150 kDa이하 단백질을 고효율로 트랜스퍼	30분 이내에 500 kDa의 고분자까지 효율적으로 트랜스퍼	주로 Wet blotting에서 사용 (Semi-dry 방식에서는 효율이 낮음)

* Methanol은 membrane과 단백질의 결합효율을 높일 수 있습니다. PVDF membrane < 15%, NC membrane <20%로 사용합니다.
* 고분자 단백질의 경우 0.01~0.05% SDS를 첨가 시 transfer 효율이 높아질 수 있습니다.
* Transfer 전에 전기영동 후의 gel을 transfer buffer로 15~30분간 equilibrium하면 transfer 효율이 높아질 수 있습니다. 단, 단백질 band가 확산되거나 저분자 단백질이 빠져나갈 수 있으니 주의하십시오.

PVDF membrane

* Pore size가 0.2 μm인 membrane을 사용해주십시오. 저분자의 경우 pore size가 크면 membrane을 통해 빠져나갈 수 있습니다.
1. Membrane이 오염되지 않도록 깨끗한 장갑을 착용하고 gel size로 자릅니다.
Mini gel size: 9 × 8.5 cm
Compact gel zie: 6.5 × 6.5 cm
ATTO 제품: WSE-4050~4053 ClearBlot P plus membrane
2. 100% Methanol에 담가서 hydrophilization합니다. (10초 이상)
3. Transfer buffer에 담가서 10~30분간 equilibrium합니다.

Filter paper

* 총 두께가 4~6 mm가 되도록 매수를 조정해주세요.
* 장시간 담가두면, filter paper가 풀어질 수 있습니다.
1. Filter paper가 오염되지 않도록 깨끗한 장갑을 착용하고 gel size로 자릅니다.
Mini gel size: 9 × 8.5 cm
Compact gel zie: 6.5 × 6.5 cm
ATTO 제품: Absorbent paper series
2. Transfer 직전에 transfer buffer에 담급니다. (10초 이상)

Blocking solution

Mini gel size 1장당 50 mL 정도 준비합니다.
BSA나 casein 등 단백질 유래의 제품과 합성 polymer 등으로 구성된 비단백질성 제품이 있습니다.
일반적으로 단백질 유래 blocking solution은 0.5~5% 농도로 TBS-T나 PBS-T에 용해하여 사용합니다.
ATTO 제품: AE-1475 EzBlock Chemi

Washing buffer

Mini gel size 1장당 50 mL 정도 준비합니다.

TBS-T	PBS-T
WSE-7235 EzTween (혹은 0.01~0.1% Tween 20) 함유한 1× WSE-7230 EzTBS (혹은 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl / pH 7.4)	WSE-7235 EzTween (혹은 0.01~0.1% Tween 20) 함유한 1× WSE-7430 EzPBS (혹은 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 81 mM Na₂HPO₄, 14.7 mM KH₂PO₄) * 인산화 단백질을 검출할 때에는 가급적 TBS-T를 사용합니다.

Antibody

Mini gel size 1장당 5~20 mL 준비합니다. 일반적으로 목적하는 단백질에 대한 primary antibody와 검출용 효소나 형광이 표지된 secondary antibody를 준비합니다. Primary antibody에 직접 표지되어 있는 경우에는 secondary antibody가 필요하지 않습니다. Antibody의 희석률은 antibody 및 검출시약의 첨부문서를 참고하여 결정합니다. 샘플 양이나 시간에 여유가 있는 경우에는 dot blotting으로 적절한 항원의 검출 감도가 되도록 희석률을 검토합니다. 또한 antibody의 의석은 antibody reaction 직전에 진행합니다. Antibody를 희석한 상태로 장시간 두면 활성을 잃을 수 있습니다.

3-3. Transfer의 세팅

아래 순서에 따라서 transfer 장치에 세팅합니다.

Membrane equilibrium
Blotting membrane을 100% methanol에 10초간 담가 hydrophilization 처리한 후, transfer buffer로 10분 이상 equilibrium합니다.
NC membrane의 경우, hydrophilization 과정은 생략합니다.

Gel washing
전기영동 후의 gel을 transfer buffer로 washing하여 gel 주위의 running buffer를 제거합니다. 고분자 단백질을 트랜스퍼할 경우, 15분 이상 담가두면 transfer 효율이 높아질 수 있습니다.

Soak filter paper
전극판에 세팅하기 직전의 filter paper를 transfer buffer에 10초 이상 담급니다. 충분히 담그지 않으면 transfer 결과에 얼룩이 생기는 원인이 됩니다. 또한 너무 장시간 담가둘 경우, filter paper가 풀어지는 경우가 있습니다.

Filter paper
전극판의 Anode plate에 filter paper를 2~3매 (총 두께 2~3 mm) 겹쳐 올립니다. Filter paper 사이에는 공기가 들어가지 않도록 잘 포개어 올립니다. Filter paer 위에 transfer buffer를 2~3 mL 떨어뜨립니다.

PVDF membrane
떨어뜨린 transfer buffer 위에 PVDF membrane을 가볍게 올려 filter paper의 네 모서리에 딱 맞도록 포개어 둡니다. Transfer buffer를 떨어뜨리고 그 위에 membrane을 올리면 겹쳐서 올리기 쉽습니다. Membrane 위에 transfer buffer를 2~3 mL 떨어뜨려 줍니다.

Gel
떨어뜨린 transfer buffer 위에 gel을 띄우듯이 올려서 membrane의 네 모서리에 gel이 딱 맞도록 포개어줍니다. Transfer buffer 위에 띄운 상태로 gel을 올리면 gel의 위치를 잡기 쉽고, PVDF membrane 위에 gel을 포개기 쉽습니다.

Filter paper
Filter paper를 2~3장 더 포개줍니다. Filter paper와 gel, membrane의 stack이 어긋나지 않도록 한 손으로 단단히 누르고, 다른손으로 가볍게 누른 상태에서 roller를 굴려서 bubble과 여분의 transfer buffer를 제거합니다. (사진 참조) 전극판을 기울여 전극판에 있는 여분의 transfer buffer를 제거합니다. Stack이 어긋나지 않도록 주의하고, roller로 stack을 밀착시킵니다. Transfer buffer가 stack에 너무 많이 남아있을 경우, blotting 후의 단백질이 흐르는 듯한 결과가 나타날 수 있습니다. 또한 bubble이 제거되지 않으면 transfer 결과에 구멍이 나타나는 원인이 됩니다. Roller는 stack의 가장자리에서 멈추지 말고 끝까지 굴려주십시오. Roller는 전기영동 방향에 대해 수직으로 밀어주십시오.

Cathode plate를 올린 후, transfer 장치를 세팅한 후 전원을 연결하여 transfer를 시작합니다.

모식도와 같이 cathode plate쪽에 gel이 오고, anode plate 쪽에 membrane이 오도록 포개어 둡니다. 단백질은 음전하를 띄고 있기 때문에 양극쪽으로 이동하며 membrane으로 이동합니다.

* Transfer pack “QBlot kit C/M/W“는 filter paper와 membrane의 준비가 필요없습니다(Ready-to-Use). 전용 transfer buffer로 transfer 효율도 높이고, 단시간에 고효율 western blotting이 가능합니다.

* 아래 동영상은 tranfser 장치 세팅 방법의 operation video입니다. 참고 바랍니다.

3-4. Transfer

1. Transfer 장치와 전원장치를 연결합니다.
2. 아래 표를 참고하여 전류/전압 조건을 설정하고 전류를 흘려줍니다.

Transfer buffer	AE-1460 EzBlot	AE-1465 EzFastBlot	WSE-7210 EzFastBlot HMW	WSE-7055 EzRun TG (Towbin method)
Transfer 조건	2 mA/cm² 60 min (~40 V)	20~25 V C.V. 5~15 min (500 mA/gel)	25 V C.V. 15~30 min (500 mA/gel)	2 mA/cm² 60 min (~40 V)

3-5. Transfer 종료 후의 조작

1. 전원장치를 끄고, transfer 장치에서 전원을 분리합니다.

2. Transfer 장치의 상부 전극판을 분리하여 filter paper를 제거하고 blotting membrane을 tweezer로 회수합니다.
* Gel은 CBB staining solution으로 staining합니다. (optional) Gel에 남아있는 band를 AE-1340 EzStain AQua로 staining하여 tranfer 효율을 확인할 수 있습니다.
* Blotting membrane을 WSE-7160 EzStain AQua MEM으로 염색하여 transfer 효율이나 transfer 얼룩이 발생하지 않았는지 확인할 수 있습니다. Destaining 후에는 antibody reaction이 가능합니다.

3. TBS-T로 blotting membrane을 washing합니다.
* Washing 후의 blotting membrane은 건조한 후에 밀폐하여 -20℃에서 보관이 가능합니다. 보관 기간은 항원의 안정성에 따라 다르지만, 일반적으로 1개월 정도입니다. 보관 후 blotting membrane은 100% methanol에 담가서 빠르게 hydrophilization하여 TBS-T로 washing한 후에 blocking 이후의 reaction을 동일하게 수행합니다.

4. Blocking solution에 담가서 blocking reaction을 진행합니다.

5. Antibody reaction을 진행한 후 검출시약으로 signal을 검출합니다.

참고 데이터

실험 예. Transfer buffer에 따른 차이

transfer efficiency according to transfer buffers

다양한 transfer buffer로 blotting 후, blotting membrane과 gel을 AE-1340 EzStain AQua (CBB)로 staining한 결과입니다. 기존의 Towbin method로 transfer 하는 것보다 AE-1460 EzBlot, AE-1465 EzFastBlot, WSE-7210 EzFastBlot HMW는 Semi-dry 방식에서도 고효율로 단백질을 transfer할 수 있습니다. AE-1465 EzFastBlot은 약 10분만에 ~150 kDa의 단백질까지 transfer하는 데에 적합하며, WSE-7210 EzFastBlot HMW는 200 kDa 이상의 고분자 단백질도 약 30분만에 Wet transfer와 동등 이상의 효율로 transfer할 수 있습니다. 또한 AE-1460 EzBlot은 단백질 밴드가 퍼지는 현상 없이 sharp한 band로 또렷하게 transfer하여 결과 확인이 가능합니다.

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QBlot kit C/M/W

Hydrophilization, equilibration이 완료된 PVDF membrane과 pad (filter paper 기능)이 세트로 구성된 semi-dry blotting용 transfer pack입니다. Bottom stack을 뜯어서 올리고 전기영동한 gel을 올린 후, Top stack을 뜯어서 올리면 바로 blotting이 가능합니다. 최단 5~10분 transfer가 가능합니다. 타사 semi-dry blotter에도 사용이 가능합니다. (호환 가능 모델은 문의주십시오.)

Transfer 분자량 범위: ~250 kDa
보존기간: 제조일로부터 1년 (냉장)
용량: WSE-4056/4057 10 stacks/box, WSE-4058 6 stacks/box

WSE-4056 QBlot kit C 구성품:
Top/Bottom Stack：65×65mm　각 10 pk
Gel Wash Buffer (5×): 100mL

WSE-4057 QBlot kit M:
Top/Bottom Stack：90×85mm　각 10 pk
Gel Wash Buffer (5×): 100mL

WSE-4058 QBlot kit W:
Top/Bottom Stack：135×85mm　각 6 pk
Gel Wash Buffer (5×): 100mL

간단한 사용법! 깔끔한 결과! Qblot kit 시리즈의 사용법 영상입니다.