Western blotting (Antibody reaction and detection)

MSDS

1. 개요

Western blotting은 target protein을 항체로 probing하고 enzyme과 fluorescence를 이용하여 검출합니다. 항체 반응은 항체의 희석배율, 반응시간이나 온도에 따라, 또한 검출의 경우 발광, 발색, 형광 등의 검출 방법 및 효소 기질의 종류에 따라 검출 감도와 signal 강도가 영향을 받아 실험 결과가 크게 달라집니다. 이번에는 ATTO의 제품을 사용하여 antibody reaction과 detection 과정에 대해서 소개합니다.

2. 실험 과정

1. 샘플 조제
세포, 조직이나 미생물 등에서 RIPA Lysis buffer나 SDS sample buffer를 이용하여 단백질을 추출하여 SDS처리 및 환원 처리를 합니다.
* 사용하는 제품 (Fractionation / Extraction Kit, Sample preparation solution)
AE-1430 EzApply, WSE-7010 EzLabel FluoroNeo, WSE-7420 EzRIPA Lysis kit, etc.
* 사용하는 제품 (Block incubator)
WSC-2615 MyMiniBLOCK C&H, etc.

2. 전기영동
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis로 단백질을 분리합니다. 목적하는 단백질이 gel의 중앙에 올 수 있도록 acrylamide의 농도를 선택합니다. 목적하는 단백질의 분자량이 불분명한 경우, gradient gel을 사용합니다. 또한 blotting 효율을 판단하기 용이하도록 prestained protein marker 등을 사용합니다. 발현량을 비교할 경우에는 control sample을 함께 전기영동합니다.
* 사용하는 제품 (Gel, Running buffer)
e-PAGEL, AE-1410 EzRun, etc.
* 사용하는 제품 (전기영동장치, Power supply)
WSE-1165 Mini-Slab, WSE-3400 myPower H300, etc.

3. Transfer
전기영동으로 분리된 단백질을 gel에서 PVDF membrane으로 이동시킵니다.
* 사용하는 제품 (Transfer buffer)
AE-1465 EzFastBlot, WSE-7210 EzFastBlot HMW, etc.
* 사용하는 제품 (Blotter, Power supply)
WSE-4125 PoweredBLOT 2M, etc.

4. Blocking
단백질 밴드가 없는 membrane 표면에 항체가 비특이적으로 결합하지 않도록 차단합니다.
* 사용하는 제품 (Blocking solution)
AE-1475 EzBlock Chemi, etc.
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

5. 항체 반응
Target protein에 대한 항체 (1차 항체) 및 HRP 등 효소로 표지된 항체 (2차 항체)와 반응합니다.
* 사용하는 제품 (항체 희석 및 Wash buffer)
WSE-7230 EzTBS, WSE-7235 EzTween, etc.
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

6. Detection
2차 항체에 표지된 효소와 반응하여 발색 또는 발광하는 기질을 이용하여 target protein 밴드를 간접적으로 검출합니다.
* 사용하는 제품 (발광/발색 시약)
WSE-7120 EzWestLumi plus, etc.
* 사용하는 제품 (Chemiluminescence imaging system)
WSE-6370 LuminoGraph III Lite, etc.

7. Stripping
Membrane에 결합한 항체를 떼어내고, 동일한 blotting membrane에서 다른 target protein을 검출할 수 있도록 합니다.
* 사용하는 제품 (Stripping solution)
WSE-7240 EzReprobe
* 사용하는 제품 (Shaker)
WSC-2400 SeesawShaker atto

3. 실험 방법

3-1. Electrophoresis ~ Blocking

	고분자의 경우	저분자의 경우
Electrophoresis	가능한 한 낮은 농도의 acrylamide를 사용합니다. 단, 7.5% 이하의 acrylamide gel은 취급이 어려우므로 gradient gel을 사용합니다.	일반적으로는 고농도의 acrylamide gel을 사용하지만 이 경우, transfer 효율이 현저히 떨어집니다. 그래서 10% 내외의 acrylamide gel과 저분자밴드가 잘 분리될 수 있는 running buffer, WSE-7065 EzRun MOPS를 사용하여 단백질을 분리합니다. 이 경우, acrylamide 농도가 균일하므로 gel의 변형을 줄일 수 있고, 10% 내외의 gel을 사용하여 고효율 transfer가 가능합니다.
Transfer	150 kDa 이상의 고분자는 transfer 효율이 현저히 나빠지므로 고분자 전용 transfer buffer인 WSE-7210 EzFastBlot HMW를 이용하여 Semi-dry blotting을 합니다. 또한 transfer 전에 gel을 transfer buffer로 equilibrium (약 30분간)을 하면 단백질의 transfer 효율이 높아질 수 있습니다. 단, equilibrium 시간이 길어지면 저분자 단백질 밴드가 gel에서 빠져나가거나 밴드가 diffusion되므로 주의가 필요합니다.	저분자 단백질 (~200 kDa)을 transfer할 경우, AE-1465 EzFastBlot을 사용하면 단시간에(약 10분) 고효율로 transfer할 수 있습니다. 저분자인 경우 blotting membrane에서 빠져나갈 수 있으므로 pore size가 0.2 μm인 PVDF membrane (ClearBlot P plus Membrane)을 사용합니다. 또한 transfer buffer에 Methanol을 첨가하면 membrane에 대한 흡착이 더 좋아집니다. (EzFastBlot 시리즈 제품에는 methanol을 첨가하지 마십시오)
Blocking	Target protein에 맞게 blocking reagent를 선택합니다. Blocking reagent의 농도가 높거나, 반응 시간이 길어지면 over-blocking이 되어 검출 감도가 낮아집니다. 반대로 반응 시간이 너무 짧으면 충분히 blocking이 되지 않고 background의 감도가 높게 나타나거나 비특이적 밴드가 나타나는 원인이 됩니다.

3-2. Antibody reaction과 Detection의 준비

Blocking을 하는 동안 Antibody를 준비합니다.

Washing buffer

Mini gel size 1장당 50 mL 정도 준비합니다.
TBS-T: WSE-7235 EzTween (또는 0.01~0.1% Tween 20)이 함유된 1× WSE-7230 EzTBS (또는 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl / pH 7.4)
PBS-T: WSE-7235 EzTween (또는 0.01~0.1% Tween 20)이 함유된 1× WSE-7430 EzPBS (또는 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 81 mM Na₂HPO₄, 14.7 mM KH₂PO₄)
* Phosphorylated protein을 검출할 때에는 가급적 TBS-T를 사용합니다.

Antibody

일반적으로 target protein에 대한 primary antibody와, 검출용 효소나 형광물질이 표지된 secondary antibody를 준비합니다. Primary antibody에 형광물질 등이 직접 표지된 경우에는 secondary antibody가 필요하지 않습니다.
Antibody의 dilution factor는 각 제품의 첨부 문서를 참고하여 결정합니다. 샘플이나 시간에 여유가 있는 경우에는 dot blotting으로 적절한 항원의 검출 감도가 되도록 dilution factor를 검토합니다. 또한 antibody의 dilution은 항체 반응 직전에 수행합니다. Antibody를 희석한 상태로 장시간 보관하면 실활될 수 있습니다.

* Antibody 선택 방법

Primary antibody:
항원 (Antigen), 교차종 (Cross reactivity), 면역동물 (host), 실험용도 (WB, IP, ICC, etc.) 및 application data 등을 참고하여 실험 목적에 맞는 것을 선택합니다. Secondary antibody를 거치지 않고 검출하는 경우에는 형광 물질 등이 표지된 Primary antibody를 선택합니다.

(예시) Target protein이 Human transferrin일 경우,
Anti-human Transferrin Rabbit Poly 등을 선택
Antigen: Human transferrin
Host: Rabbit (그 외 Mouse, Goat 등)
Cross reactivity: Human, Mouse, Rat (반드시 Human이 포함되는 것)
Application: WB (Western blotting, WB가 반드시 포함될 것), ELISA, IP (Immunoprecipitation)

Secondary antibody:
Primary antibody와 동일하나 검출 방법에 적합한 발광 물질 등 (HRP, ALP, Rhodamin, etc.)이 표지되어 있는 것을 선택합니다.

(예시) 상기의 Primary antibody에 대한 secondary antibody
Goat Anti- Rabbit IgG H&L (HRP labeled) 등
Host: Goat (Primary antibody host인 Rabbit 및 target protein인 Human이 포함되지 않은 것)
Antigen: Rabbit IgG H&L (Primary antibody Host의 antibody. Primary antibody가 monoclonal antibody인 경우, 항체의 isotype (IgG, IgA, IgM 등)에 주의하고, 또한 Fab이 fragmented된 경우 Fc만 인식하는 antibody는 제외하도록 선택합니다)
Cross reactivity: – (가능한 한 교차종이 없는 것)
Application: WB, ELISA, IP (반드시 WB가 포함되는 것)
Conjugate: HRP (일반적으로 발광 검출을 하는 경우는 HRP 또는 ALP)

Detection reagent

형광 색소로 표지된 antibody를 사용한 경우 검출시약이 필요하지 않습니다. 각 형광색소에 적합한 emission light를 사용하여 excitation된 특정 파장의 형광을 filter 등으로 분리하여 얻습니다. ALP (Alkaline Phosphatase)나 HRP (Horseradish Peroxidase)등의 효소로 표지된 antibody를 사용한 경우는, 각각의 효소의 기질로 이루어진 검출 시약을 사용하여 signal을 얻습니다. ATTO에는 아래 3종류의 HRP에 대한 detection reagent가 있습니다.

	WSE-7140 EzWestBlue W	WSE-7110 EzWestLumiOne	WSE-7120 EzWestLumi plus
검출 방법	TMB에 의한 발색	Luminol에 의한 발광	Luminol에 의한 발광
사용 방법	Membrane을 용액에 침지하여 10~30분간 반응	Membrane을 용액에 침지한 후 바로 검출	사용 직전에 A, B 용액을 1:1로 혼합한 후 Membrane을 용액에 침지한 후 바로 검출
검출 감도	pg	low-pg	mid-femto
지속 시간	-	1 hr <	3 hr <

3-3. Antibody reaction과 detection 방법

아래 순서에 따라서 antibody reaction ~ detection 반응 및 촬영을 합니다.

Primary antibody reaction (1st Ab reaction)
Blocking 종료 후 blocking solution을 폐기하고 TBS-T 등에 희석한 primary antibody를 첨가합니다. Primary antibody의 희석 배율은 사용하는 제품의 사용법을 바탕으로 판단합니다. 일반적으로는 100~5,000배로 TBS(-T) 또는 PBS(-T)로 희석합니다. 일반적으로는 실온에서 약 1시간, 혹은 4℃에서 overnight동안 shaking하면서 incubate합니다. Antibody에 따라서 온도와 시간은 검토할 필요가 있습니다.

Washing
Antibody solution을 폐기하고 소량의 TBS-T / PBS-T로 가볍게 헹궈줍니다. 새 TBS-T / PBS-T를 약 50 mL/membrane을 첨가하여 5분간 shaking하면서 incubating합니다. 이 washing 과정을 3회 반복합니다.

Secondary antibody reaction (2nd Ab reaction)
Washing 용액(TBS-T / PBS-T)을 폐기하고 효소나 형광물질이 표지된 secondary antibody를 첨가합니다. Secondary antibody의 희석 배율은 사용하는 제품의 사용법을 바탕으로 판단합니다. 일반적으로는 5,000~500,000배로 TBS-T / PBS-T로 희석합니다. Background가 높은 경우에는 TBS-T / PBS-T 대신에 blocking solution(제품 매뉴얼에 따라서 적당히 dilution)을 사용합니다. 일반적으로는 실온에서 약 1시간, 혹은 4℃에서 overnight동안 shaking하면서 incubate합니다.

Detection
Detection 직전에 detection reagent를 계량하거나 mix하는 등의 조정을 합니다. 깨끗한 wrap 또는 용기에 조정한 detection reagent를 모두 붓습니다. Blotting membrane을 핀셋 등으로 집어서 여분의 TBS-T / PBS-T를 페이퍼타올로 완전히 제거합니다. Blotting membrane을 detection reagent에 담가줍니다. 이 때, 공기가 들어가지 않도록 조심하여 빠르고 균일하게 detection reagent가 membrane에 퍼지도록 합니다. Membrane의 앞뒷면에 시약이 충분히 침투되는지 확인합니다. 발색 검출의 경우는 충분히 발색될 때까지 반응한 후, 증류수로 헹군 후 signal을 촬영합니다. 발광 검출의 경우는, membrane을 wrap이나 film sheet (Pitatt Clear 등)에 밀폐하여 촬영 장비를 사용하여 촬영합니다.

Imaging
고감도 발광/형광 촬영 장치를 사용하여 발광 또는 형광 signal을 촬영합니다.
* 발광 촬영의 경우
조리개는 최대한 열고, filter 등은 사용하지 않습니다. 밀폐된 blotting membrane을 촬영구역의 중앙에 두고 focus를 맞춥니다. 촬영 모드 (Standard, High 등)를 선택하고 촬영 시간 (5 sec, 1 min, 3 min 등)을 설정하여 촬영합니다. Prestained marker를 사용했을 경우에는 merge된 image를 얻기 위해서 Epi-white를 이용하여 이미지를 한 장 더 촬영합니다.
* 형광 촬영의 경우
표지된 형광 색소에 적합한 emission light를 사용하고, 그에 적합한 excitation filter를 사용합니다. 밀폐된 blotting membrane을 촬영구역의 중앙에 두고, emission light를 켠 채로 focus를 맞추어 촬영합니다.

참고 데이터

실험 예. Antibody의 희석 농도에 따른 영향

Differences in sensitivity according to the dilution factor of antibodies

위 사진은 200 pg/lane부터 1/2로 serial dilution한 Human transferrin을 전기영동하여 transfer한 blotting membrane을 human transferrin antibody 및 HRP-labeled secondary antibody와 반응하여 검출한 결과입니다. Primary antibody 및 Secondary antibody의 희석 배율을 오른쪽 표와 같이 다르게 반응하여 WSE-7110 EzWestLumiOne과 WSE-7120 EzWestLumi plus로 밴드를 검출한 결과입니다. 조건 2에 비해 조건 1은 Primary antibody 농도가 절반 이하이지만, 결과는 거의 차이가 없습니다. 반대로, 조건 2와 조건 3은 Primary antibody 농도는 동일하지만, Secondary antibody 농도가 5배이며, 조건 3은 signal의 강도와 검출 감도도 훨씬 높은 것을 알 수 있습니다. 또한 조건 1과 조건 4는 Secondary antibody 농도는 동일하지만, Primary antibody 농도가 5배입니다. 검출 감도는 Primary antibody가 높을수록 높지만, signal 강도는 약합니다. 이처럼 동일한 단백질량을 전기영동하여 transfer한 blotting membrane을 사용하더라도 Primary antibody와 Secondary antibody의 농도에 따라 검출 감도와 신호 강도가 크게 다르다는 것을 알 수 있습니다. 물론, detection reagent에 따라서도 검출 감도는 다르지만, 검출 시약뿐만 아니라 항체 농도의 선택도 중요함을 알 수 있습니다.

실험 예. Detection reagent의 Duration time

위 사진은 500 pg/lane부터 1/2로 serial dilution한 Human transferrin을 전기영동하여 transfer한 blotting membrane을 1/4,000 희석한 human transferrin antibody 및 1/10,000 희석한 HRP-labeled secondary antibody와 반응하여 WSE-7110 EzWestLumiOne과 WSE-7120 EzWestLumi plus로 밴드를 검출한 결과입니다. 위 결과와 같이 WSE-7110 EzWestLumiOne은 1시간 이상 signal이 안정되고, WSE-7120 EzWestLumi plus는 발광 강도는 약간 떨어지지만 3시간까지 안정적으로 signal을 검출할 수 있음이 나타났습니다.

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QBlot kit C/M/W

Hydrophilization, equilibration이 완료된 PVDF membrane과 pad (filter paper 기능)이 세트로 구성된 semi-dry blotting용 transfer pack입니다. Bottom stack을 뜯어서 올리고 전기영동한 gel을 올린 후, Top stack을 뜯어서 올리면 바로 blotting이 가능합니다. 최단 5~10분 transfer가 가능합니다. 타사 semi-dry blotter에도 사용이 가능합니다. (호환 가능 모델은 문의주십시오.)

Transfer 분자량 범위: ~250 kDa
보존기간: 제조일로부터 1년 (냉장)
용량: WSE-4056/4057 10 stacks/box, WSE-4058 6 stacks/box

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WSE-4057 QBlot kit M:
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간단한 사용법! 깔끔한 결과! Qblot kit 시리즈의 사용법 영상입니다.