Normalization (Western blotting data)

MSDS

1. Introduction

Western blotting은 target protein을 검출하기 위해 가장 많이 사용되는 방법입니다. Target protein 발현량의 변화나 샘플 간 발현량의 비교를 검출하기 위해서는 target protein의 양을 정량할 필요가 있습니다. 일반적으로 Western blotting의 data는 sample간, lane간에 불균형이 있습니다. 그러한 영향을 최소화하기 위해서 지표(Reference)를 이용하여 보정(normalize)합니다. Normalization 방법에는 Housekeeping protein(HKP)를 이용한 방법과, Total protein (TP)를 이용한 방법이 있습니다. 여기에서는 ATTO 제품을 이용하여 HKP, TP에 따른 data normalization 방법을 소개합니다.

2. Normalization은 왜 해야하나요?

샘플의 불균일
생물종이나 조직, 발생 단계에 따른 차이, 추출 방법 등에 의해 영향을 받습니다.
Loading양의 불균일
단백질 정량방법이나 추출 용매의 영향, 전기영동 샘플 loading 시 오차 등에 의해 영향을 받습니다.
Transfer 효율, Detection 효율, 항체 반응의 불균일
Transfer buffer의 종류, Transfer 방법, 항체의 Titer 값, 희석률과 반응 시간 등에 의해 영향을 받습니다.
여러 Blotting 간의 비교
많은 검체를 비교할 때 여러 blotting membrane을 비교할 때, 기준이 필요합니다.

3. Normalization의 Reference

Housekeeping protein normalization (HKPN)

β-actin, GAPDH, HPRT1 등 HKP은 여러 실험에서 동일한 수준에서 발현되는 것으로 생각되어 Western blotting에서 대조군으로 자주 사용됩니다.

Flourescent antibodies
Target protein과 normalization control 모두 dynamic range 내의 형광물질이 필요합니다.
Membrane stripping
여러 번 전기영동과 transfer를 할 필요가 없이 1장의 blotting membrane으로 여러 target protein을 검출하는 방법입니다. Blotting membrane의 antibodies를 떼어내고 새로운 검출용 antibody를 사용하여 다시 probing해야 합니다. 고농도의 단백질 signal을 완전히 제거하는 것을 어려울 수 있으므로, 낮은 발현율의 단백질을 먼저 검출하는 것이 좋습니다.
Exogenous spike-in controls
HKP 수치가 조직 간에 일정하지 않을 수 있기 때문에, antibody의 linear range 내에서 알려진 농도의 순수한 exogenous protein을 주입하여 control로 사용할 수 있습니다. HKP와 비교하여 spike-in controls에 더 다양한 단백질을 사용할 수 있습니다.

Total protein normalization (TPN)

각 lane의 총 단백질 양으로 target protein 양을 normalization합니다. Fluorescent stains 방법과 Stain-free technology를 이용한 방법은 Gel/blotting membrane의 단백질을 시각화하기 위한 특수 장비가 필요합니다.

Pre-antibody stains
Ponceau S와 같은 음이온 stains와 Sypro Ruby, Deep Purple 같은 형광 stains는 downstream immunodetection에 영향을 주지 않기 때문에 antibodies 처리 전에 사용됩니다. Ponceau S는 가역염료로 staining후에 DW로 씻으면 쉽게 제거됩니다.
ATTO의 WSE-7010 EzLabel FluoroNeo는 샘플 처리 시에 형광 labeling하고, gel이나 blotting membrane 단계에서 검출이 가능하며, blotting 결과에 영향을 주지 않습니다.
Sypro Ruby, WSE-7010 EzLabel FluoroNeo와 같은 형광 stains는 UV, Blue LED 등으로 시각화할 수 있습니다. 형광 stains는 linear range가 넓고 음이온 stains보다 감도가 높습니다.
Post-antibody stains
Amido black은 흔하게 사용되는 영구적인 음이온성 stains입니다. Ponceau S보다 감도가 높으며, immunodetection 이후에 처리합니다.
Stain-free technology
Stain-free technology는 시각화를 위해 PAGE gel에 TCE를 첨가하여 제작합니다. Gel이나 blotting membrane을 UV(312 nm)에서 약 1분정도 조사하여 촬영합니다. Stain-free technology는 tryptophan residue가 없는 단백질은 검출할 수 없습니다. 최소 2개의 tryptophan이 있어야 검출이 가능하며, tryptophan 유무와 수에 따라서 signal의 강도가 달라지므로, 형광검출이나 Coomassie Brilliant Blue 검출의 패턴과 차이가 날 수 있습니다.

4. Experimental Flow

위의 그림은 Western blotting의 실험과정입니다. Normalization을 위해서는 Housekeeping protein 또는 Total protein의 intensity 분석이 필요합니다.

1. Stripping을 통한 Houseekeeping protein 분석

Detection이 끝난 membrane을 WSE-7240 EzReprobe 등의 stripping solution을 사용하여 Ab를 모두 떼어낸다.
Blocking 과정부터 다시 진행하여, Houseekeeping protein에 대한 antibody를 사용하여 다시 detection한다. 이 결과를 Housekeeping protein data로 사용하여 normalization에 이용합니다.

2. Sample labeling을 통한 Total protein 분석

Sample preparation 과정에서 기존 Sample buffer 대신 WSE-7010 EzLabel FluoroNeo를 사용하여 단백질 샘플을 형광표지합니다. 이 샘플은 일반적인 gel, running buffer, 전기영동 조건으로 분리가 가능합니다. WSE-7010 EzLabel FluoroNeo를 사용하여 조제한 샘플로 전기영동한 gel은 즉시 Blue LED, UV, Cyan 등으로 밴드 패턴을 확인할 수 있습니다.
전기영동 후에는 일반적은 transfer 조건으로 트랜스퍼가 가능합니다. Membrane도 Blue LED, UV, Cyan 광원으로 검출이 가능합니다. Gel 또는 Membrane으로 검출한 결과를 total protein data로 사용하여 normalization에 이용합니다.
Membrane은 blocking 과정부터 동일하게 진행하여 target protein을 검출합니다.

3. Stain-free technology를 사용한 Total protein 분석

Electrophoresis 과정에서 TCE가 포함된 PAGE gel을 사용합니다. Gel 조성은 아래 표를 참조하십시오. 전기영동 후의 gel은 즉시 형광검출이 불가능합니다. 단백질을 가시화하기 위해 gel을 UV조사장치 위에 두고 약 1분간 조사한 후에 gel 이미지를 촬영합니다. UV파장은 312 nm를 사용합니다.
Transfer는 통상의 조건으로 transfer가 가능합니다. Membrane은 형광이 적은 형광검출용 PVDF membrane 사용을 권장합니다. 가시화처리를 한 Stain-free gel은 transfer 후 PVDF membrane 상의 band도 gel과 동일하게 형광 검출이 가능합니다. Gel 상의 단백질 또는 PVDF membrane 상의 단백질 band를 Total protein data로 사용하여 normalization에 이용합니다.
Membrane은 blocking 과정부터 동일하게 진행하여 target protein을 검출합니다.

Reference
C.L. Ladner et al., Analytical Biochemistry 326 (2004) 13–20, Visible fluorescent detection of proteins in polyacrylamide gels without staining [PubMed]

	Separating gel				Stacking gel
Gel concentrations	7.5%	10%	12.5%	15%	4.5%
DW	5 mL	4.2 mL	3.3 mL	2.5 mL	3 mL
30% acrylamide mix*	2.5 mL	3.3 mL	4.2 mL	5 mL	0.75 mL
1.5 M Tris (pH 8.8)	2.5 mL	2.5 mL	2.5 mL	2.5 mL	-
1.0 M Tris (pH 6.8)	-	-	-	-	1.25 mL
TCE**	0.05 mL	0.05 mL	0.05 mL	0.05 mL	0.05 mL
10% APS	0.075 mL	0.05 mL	0.05 mL	0.05 mL	0.05 mL
TEMED	0.005 mL	0.005 mL	0.005 mL	0.005 mL	0.005 mL

* 30% acrylamide mix: 30(w/v)% acrylamide/bis (29:1) solution
** TCE: 2,2,2-Trichloroethanol (CAS 115-20-8)
위의 표는 Gel 1장 제작에 필요한 용량입니다. SDS-PAGE의 경우, Gel에 SDS가 포함되어 있지 않아도 SDS가 포함된 Running buffer를 사용하면 됩니다. 또는 DW volume을 줄이고 SDS를 첨가하여 제작도 가능합니다.

4. Membrane staining을 통한 Total protein 분석

Transfer한 후의 membrane을 Ponceau S 또는 WSE-7160 EzStain AQua MEM 등의 시약을 사용하여 staining합니다. Staining한 membrane은 발색이 되어 별도의 장치없이 시각화가 가능합니다. 이후, 사용한 시약의 매뉴얼에 따라서 destaining 과정을 진행한 후에, blocking 과정부터 동일하게 진행하여 target protein을 검출합니다.
시각화한 이미지는 Total protein data로 사용하여 normalization에 이용합니다.