Method for extracting protein from tissue or cell
ย 1. Introduction
“Protein”์ ์ด์์ ๊ทธ๋ฆฌ์์ด์ “Proteios (๊ฐ์ฅ ์ค์ํ ๊ฒ)”์์ ์ ๋ํ๋ค๊ณ ํฉ๋๋ค. ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์์ฒด์ ๊ตฌ์กฐ์ ๊ธฐ๋ฅ์ ๋ด๋นํ๋ ๋ฐ ํ์์ ์ธ ์กด์ฌ๋ผ๊ณ ํ ์ ์์ต๋๋ค. ๋จ๋ฐฑ์ง์ ๊ธฐ๋ฅ์ ์ฐ๊ตฌํ๊ธฐ ์ํด์๋ ๋จผ์ , ์์ฒด ์ํ์์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ์ฌ ๊ฐ์ฉํํ๋ ๊ฒ์ด ์ค์ํฉ๋๋ค. ์ฌ๊ธฐ์์๋ ์ํ ์ ์ ํ์ ์ฌ์ฉํ์ฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ๋ ๋ฐฉ๋ฒ์ ๋ํด ์๊ฐํ๊ฒ ์ต๋๋ค.
โถ ์ฃผ์ํ ์
๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ ๋ ๊ธฐ๋ณธ์ ์ธ ์ฃผ์์ ์ผ๋ก๋
1. ์ํ ์ ํ (์ ์ ํ๊ณ ์ํ๋ ๋ชฉ์ ์ ์๊ธฐ ์ฌ์ด ์ํ ์ ํ)
2. ์จ๋ (์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก 0~4โ)
3. pH, ์ด์จ๊ฐ๋ (ionic strength): pH๋ ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก pH 4~7, ์ด์จ๊ฐ๋๋ 0.1M
4. Thiol๊ธฐ (์ฐํ๋ฅผ ๋ณดํธํ๊ธฐ ์ํ DTT ๋ฑ์ ํ์์ ์ฒจ๊ฐ)
5. ์์ ํ์ ์ ์ฒจ๊ฐ (๋น์ด๋ ๊ธ๋ฆฌ์ธ๋ฆฐ ๋ฑ์ ์ฒจ๊ฐ)
6. Protease inhibitor์ ์ฒจ๊ฐ
7. ๊ธ์์ด์จ chelate ๋ฑ์ด ์์ต๋๋ค.
ย 2. ๋์ฅ๊ท ์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ ๋ฐฉ๋ฒ
๋์ฅ๊ท ๊ณผ ๊ฐ์ ๋ฏธ์๋ฌผ์๋ ์ธํฌ๋ฒฝ์ด ์๊ธฐ ๋๋ฌธ์ Mammalian cell์ ๋นํด ํ๊ดดํ๋ ๊ฒ์ด ์ด๋ ต์ต๋๋ค. ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก๋ ์ด์ํ ํ์, ๋๊ฒฐ ์ตํด๋ฅผ ํตํ ํ์, Lysozome๋ฑ์ ํจ์์ ์ํ ์ฉํด ๋ฑ์ ํตํด ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํฉ๋๋ค. ๊ทธ๋ฌ๋ ์ด์ํ๋ ๋๊ฒฐ ์ตํด์ ์ํ ๋ฌผ๋ฆฌ์ ํ์๋ ์กฐ์์ด ๋ฒ๊ฑฐ๋กญ๊ณ ์ข ์ข ๋จ๋ฐฑ์ง์ด ๋ณ์ฑ๋๋ ์์ธ์ด ๋ฉ๋๋ค. ATTO์ WSE-7423 EzBactYeastCrusher๋ ๊ท ์ฒด์ ๋ฃ๊ณ ์๋ ๊ฒ๋ง์ผ๋ก๋ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์์ ์ ์ผ๋ก ์ถ์ถํ ์ ์์ต๋๋ค.
2-1. ์คํ๋ฐฉ๋ฒ
์คํ์ฌ๋ฃ:
๋์ฅ๊ท ๋ฐ ๋ฐฐ์์ก
WSE-7423 EzBactYeastCrusher
์ฆ๋ฅ์
๋ง์ดํฌ๋ก ์์ฌํ๋ธ, ํผํซ tip ๋ฑ
์์ฌ๊ธฐ, ๋ง์ดํฌ๋กํผํซ ๋ฑ

๋์ฅ๊ท ๋ฐฐ์
๋์ฅ๊ท ์ ์ ๋นํ ๋ฐฐ์ง์์ O.D. 600=0.5~1.0์ด ๋ ๋๊น์ง ๋ฐฐ์ํฉ๋๋ค. (๊ท ์ฒด๋์ผ๋ก๋ 50~100 mg ์๋น)
* ๋์ฅ๊ท ๋ฐํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ๋ ๊ฒฝ์ฐ์๋ ๋ฐํ์ฉ ๋์ฅ๊ท ๋ฐ ๋ฐํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ์ ํ ์กฐ๊ฑด์์ ๋ฐฐ์ํ ๊ฒ์ ๊ถ์ฅํฉ๋๋ค.
Collect, Washing
๋์ฅ๊ท ์ 2,000รg๋ก 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ ์ ๊ฑฐํฉ๋๋ค. Pellet์ 5~10mL์ ์ฆ๋ฅ์๋ฅผ ๋ํด ํํํ์ฌ ๋ค์ 2,000รg์์ 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ ์ ๊ฑฐํฉ๋๋ค.
* Washingํ์ Pellet (๊ท ์ฒด)๋ -80โ์์ ๋๊ฒฐ๋ณด์กด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค. ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก ํ ๋ฒ ๋๊ฒฐํ๋ฉด ์ถ์ถ ํจ์จ์ด ๋์์ง๋๋ค.
๊ท ์ฒด ์ฉํด
์๋ฑ์ก์ ์ ๊ฑฐํ๊ณ ๊ท ์ฒด๋ฅผ vortexํ์ฌ ์ธํฌ๋ฅผ ์ ํ์ด์ค๋๋ค. ์ด ๋ ๊ท ์ฒด๋ฅผ ๊ท ์ผํ๊ฒ ์ ํ์ด์ฃผ๋ ๊ฒ์ด ์ค์ํฉ๋๋ค.
0.5 mL์ EzBactYeast Lysis buffer๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ ์ค์จ์ 10๋ถ๊ฐ ๋ก๋๋ค.
* EzBactYeast Lysis buffer์ ๋ฏธ๋ฆฌ EzBactYeast Crusher ํคํธ์ ํฌํจ๋ Protease Inhibitor์ DNase I์ ์ฒจ๊ฐํฉ๋๋ค.
๋จ๋ฐฑ์ง Extraction
๊ท ์ฒด์ฉํด์ก์ 4โ, 10,000รg์์ 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ ๋ชจ์์ค๋๋ค.
* ๋ถ์ฉ์ฑ ๋จ๋ฐฑ์ง์ Pellet์ ํ์๋ฉ๋๋ค. ๋ถ์ฉ์ฑ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ ๋์๋ Pellet์ 8M Urea contained buffer๋ 6M Guanidine-HCl contained buffer ๋ฑ์ ์ฒจ๊ฐํด ์ฉํดํ์ฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ์ฌ ์ฃผ์ญ์์ค.
์ผ๋ฐ์ ์ธ ๋์ฅ๊ท ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ๋ฐฉ๋ฒ
1. ๋์ฅ๊ท ์ ํ์์ฉ ์ฉ์ก(50 mM Tris pH8.0, 500 mM NaCl, 15% glycerol, 10 mM imidazole)์ผ๋ก 3ํ ์ธ์ฒํ๋ค.
2. Pellet์ 3๋ฐฐ ์ฉ๋์ Sonication buffer์ ํํํ๊ณ , ์ต์ข
๋๋๊ฐ 1 mg/mL Lysozyme, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA๊ฐ ๋๋๋ก ์ฒจ๊ฐํ๋ค.
3. ๋์ฅ๊ท ์ด ํ์๋ ๋๊น์ง ๋๊ฐํ๋ฉด์ ์ด์ํ ํ์๋ฅผ ์ค์ํ๋ค (ํ๋ฏธ๊ฒฝ ๋ฑ์ผ๋ก ํ์ธ).
4. DNase I์ ์ต์ข
๋๋๊ฐ 0.1 mg/mL์ด ๋๋๋ก ์ฒจ๊ฐํ๋ค.
5. ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ(10,000รg~25,000รg, 10~30๋ถ)ํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ ํ์ํ๋ค.
2-2. ์ฐธ๊ณ ๋ฐ์ดํฐ
์คํ์1: ์ถ์ถ ํจ์จ

์ถ์ถ์ ์ฌ์ฉํ ์์ฝ
A: WSE-7423 EzBactYeastCrusher (์ค์จ)
C: ํ์ฌ ์ํ ์์ฝ
B: ํ์ฌ ์ํ ์์ฝ
L: Lysozyme
S: SDS sample buffer
A: WSE-7423 EzBactYeastCrusher (4โ)
M: EzProtein Ladder

Luciferase ๋ฐํ ๋์ฅ๊ท ์์ ์์ ๊ธฐ์ฌ๋ ์์ฝ์ ์ฌ์ฉํ์ฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ๊ณ , ์ ๊ธฐ์๋ํ ๊ฒฐ๊ณผ (์)์ ํจ์ ํ์ฑ์ ์ธก์ ํ ๊ฒฐ๊ณผ (์ผ์ชฝ)์ ๋ํ๋์ต๋๋ค.ย WSE-7423 EzBactYeastCrusher๋ ์ค์จ์์๋, ์ ์จ(4โ)์์๋ ๋์ผํ๊ฒ ํ์ฌ ์ํ ์์ฝ๊ณผ ๋๋ฑ ์ด์์ ์ถ์ถ ํจ์จ๋ก ๋จ๋ฐฑ์ง์ ํ์ํ ์ ์์ต๋๋ค.
๋ํ ์ผ์ชฝ์ ๊ทธ๋ํ์ ์ ์๋ ๋ฐ์ ๊ฐ์ด ์ค์จ์์ ์ถ์ถํ ๊ฒฝ์ฐ์๋ ํจ์ ํ์ฑ์ ๋๊ฒ ์ ์งํ ์ํ์์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ์ด ๊ฐ๋ฅํจ์ ์ ์ ์์ต๋๋ค.
์คํ์2: ๋ฐํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ์

๊ทธ๋ฆผ์ His tag-Luciferase ๋ฐํ ๋์ฅ๊ท ์์ WSE-7423 EzBactYeastCrusher๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ ์ถ์ถํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ Ni-Sepharose ์ปฌ๋ผ์ผ๋ก ์ ์ ํ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ๋ํ๋์ต๋๋ค. WSE-7423 EzBactYeastCrusher๋ ์ปฌ๋ผ์ผ๋ก์ ๊ฒฐํฉ, ๊ฐ ์ ์ ์คํ ์ ๋ฐ์์ ์ ํดํ์ง ์์ผ๋ฉฐ ํจ์ ํ์ฑ๋ ์ ์งํ ์ํ์์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ์ ํ ์ ์์ต๋๋ค. ์ด์ ๊ฐ์ดWSE-7423 EzBactYeastCrusher๋ ๋์ฅ๊ท ๊ณ ๋ฐํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถ ๋ฐ ์ ์ ์๋ ์ ํฉํ ๊ฒ์ผ๋ก ๋ํ๋ฌ์ต๋๋ค.

M: WSE-7020 EzProtein Ladder
Ext: Whole Extract
FT: Flow through
W: Wash
E1: Extraction 1
E2: Extraction 2 (Purified protein)
ย 3. ํจ๋ชจ์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ ๋ฐฉ๋ฒ
ํจ๋ชจ์๋ ๋ค๋น๋ฅ๋ฅผ ์ฃผ์ฑ๋ถ์ผ๋ก ํ ๊ฒฝ์ง ์ธํฌ๋ฒฝ์ด ์๊ธฐ ๋๋ฌธ์ ๋์ฅ๊ท ๋ณด๋ค ํ๊ดดํ๋ ๊ฒ์ด ์ด๋ ต์ต๋๋ค. ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก๋ Glass beads ๋ฑ์ ์ฐ๋ง์ ๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ Homogenizer, French press ๋ฑ์ ๊ฐ์๊ฐ์์ฒ๋ฆฌ์ ์ํ ํ์, ์ด์ํ ํ์, Zymolyase๋ฑ์ ํจ์์ ์ํด Protoplastํ๋ ์ดํ์ ์ฉํด ๋ฑ์ด ์ฃผ๋ฅ์ ๋๋ค. ๊ทธ๋ฌ๋ ๋ฌผ๋ฆฌ์ ํ๊ดด๋ ์ถ์ถ ํจ์จ์ ๋์ง๋ง ์กฐ์์ด ๋ฒ์กํ๊ณ ๋ฌผ๋ฆฌ์ ์์์ด ํฌ๋ฉฐ, ๋ Protoplastํ๋ ์กฐ๊ฑด์ ์ต์ ํ๊ฐ ์ด๋ ต๋ค๊ณ ํฉ๋๋ค. ATTO์ WSE-7423 EzBactYeastCrusher๋ Protease Inhibitor์ DNase I์ด ํฌํจ๋์ด ์์ด ๊ท ์ฒด์ ์๋ ๊ฒ๋ง์ผ๋ก๋ Glass beads๋ฒ๊ณผ ์ ์ฌํ ์ถ์ถํจ์จ๋กย ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์์ ์ ์ผ๋ก ์ถ์ถํ ์ ์์ต๋๋ค. (Schizosaccharomyces pombe๋ ์ถ์ถํจ์จ์ด ๋จ์ด์ง๋๋ค.)
3-1. ์คํ๋ฐฉ๋ฒ
์คํ์ฌ๋ฃ
๊ท ์ฒด ๋ฐ ๋ฐฐ์์ก (10 mL)
WSE-7423 EzBactYeastCrusher
์ฆ๋ฅ์
๋ง์ดํฌ๋ก ์์ฌํ๋ธ, ํผํซ tip ๋ฑ
์์ฌ๊ธฐ, ๋ง์ดํฌ๋กํผํซ ๋ฑ

ํจ๋ชจ ๋ฐฐ์
ํจ๋ชจ๋ฅผ ์ ๋นํ ๋ฐฐ์ง์์ O.D.600=0.5~1.0์ด ๋ ๋๊น์ง ๋ฐฐ์ํฉ๋๋ค. (๊ท ์ฒด๋์ผ๋ก๋ 50~100 mg ์๋น)
* ๋ฐํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ ๊ฒฝ์ฐ์๋ ๋ฐํ์ฉ ํจ๋ชจ ๋ฐ ๋ฐํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ์ ํ ์กฐ๊ฑด์์ ๋ฐฐ์ํ ๊ฒ์ ๊ถ์ฅํฉ๋๋ค.
Collect, Washing
ํจ๋ชจ๋ฅผ 2,000รg์์ 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์ง๊ท ํฉ๋๋ค. Pellet์ 5~10 mL์ ์ฆ๋ฅ์๋ฅผ ๋ฃ์ด ํํํ์ฌ ๋ค์ 2,000รg์์ 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์ง๊ท ํฉ๋๋ค.
* ์ธ์ฒ ํ์ Pellet์ -80โ์์ ๋๊ฒฐ๋ณด์กด์ด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค. ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก ํ ๋ฒ ๋๊ฒฐํ๋ฉด ์ถ์ถ ํจ์จ์ด ๋์์ง๋๋ค.
Pretreatment
์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ ์๋ฑ์ก์ ์ ๊ฑฐํ๊ณ , ๊ท ์ฒด๋ฅผ vortexํ์ฌ ์ธํฌ๋ฅผ ์ ํ์ด์ค๋๋ค(์ค์). 0.5 mL์ Yest PreLysis buffer๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ vortexํ ํ, ์ค์จ์์ 5๋ถ๊ฐ ์ ์นํฉ๋๋ค.
* ์คํ์ ์ง์ ์ด ์๋ ๊ฒฝ์ฐ์๋, DTT๋ฅผ 5~50 mM ๋๋๋ก ์ฒจ๊ฐํ๋ฉด ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ ํจ์จ์ด ๋์์ง๋๋ค.
๊ท ์ฒด ์ฉํด
์ธํฌํํ์ก์ 10,000รg์์ 5์ด๊ฐ(4โ) ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ๊ณ ํ์ํ ๊ท ์ฒด๋ฅผ vortexํ์ฌ Pellet์ ์ ํ์ด์ค๋๋ค(์ค์).
0.5 mL์ EzBactYeast Lysis buffer๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ ์ค์จ์์ 10๋ถ๊ฐ ์ ์นํฉ๋๋ค.
* EzBactYeast Lysis buffer ์๋ ๋ฏธ๋ฆฌ WSE-7423 EzBactYeastCrusher์ ์ฒจ๋ถ๋ Protease Inihibitor ์ DNase I ๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํฉ๋๋ค.
* ์ถ์ถํจ์จ์ ๋์ผ ๊ฒฝ์ฐ์๋ ์ฐ์ธ์ฒํ Glass beads (ฯ0.5 mm)๋ฅผ ์ฌ์ฉํฉ๋๋ค (Schizosaccharomyces pombe๋ ํ์).
๋จ๋ฐฑ์ง Extraction
์ธํฌ์ฉํด์ก์ 4โ, 10,000รg์์ 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ ํ์ํฉ๋๋ค.
์ผ๋ฐ์ ์ธ ํจ๋ชจ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ๋ฐฉ๋ฒ
1. ํจ๋ชจ๋ฅผ ํ์์ฉ ์ฉ์ก(0.33 M Sucrose, 0.3 M Tris/pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 100 mM 6-Aminohexanoic acid)์ผ๋ก Washingํ๋ค.
2. ํ์์ฉ๊ธฐ์ ๊ท ์ฒด๋ฅผ ๋ฃ๊ณ ์ฉ๊ธฐ์ 40% ์ฉ๋์ ์ฐ์ธ์ ํ Glass beads๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ๋ค.
3. Bead homogenizer์ ์ฅ์ฐฉํ๊ณ Pulse๋ฅผ 1๋ถ๋์, ์ด 3~5๋ถ๊ฐ ํ์ํ๋ค.
4. ํ์ ํ, ํ์ํ ๊ฒฝ์ฐ 1 M Tris/pH 7.4๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ pH๋ฅผ ์กฐ์ ํ๋ค.
5. 14,000รg์์ 30๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ ํ์ํ๋ค.
3-2. ์ฐธ๊ณ ๋ฐ์ดํฐ
์คํ์3: ํจ๋ชจ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ ํจ์จ์ ๋น๊ต

์ถ์ถ์ ์ฌ์ฉํ ์์ฝ
P: PBS
A:ย WSE-7423 EzBactYeastCrusher
C: ํ์ฌ ์ํ ์์ฝ
Y: ํ์ฌ ์ํ ์์ฝ
AD:ย WSE-7423 EzBactYeastCrusherย + 5 mM DTT
์ด ์ฌ์ง์ YPD ๋ฐฐ์ง์์ ๋ฐฐ์ํย Saccharomyces cerevisiae 5 mL์ ๋ฐฐ์์ก์์ ์ธํฌ๋ฅผ ํ์ํ๊ณ , ์์ ๊ธฐ์ฌํ ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ์ฌ ์ ๊ธฐ์๋ํ ๊ฒฐ๊ณผ์ ๋๋ค. Glass beads๋ฒ์ ์ธํฌ์ ์ฝ 2.5๋ฐฐ ์ฉ๋์ Glass beads์ ๊ฐ ์ถ์ถ์ก 0.2 mL์ ์ฒจ๊ฐํ๊ณ 10๋ถ๊ฐ vortexํ์ฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ์์ต๋๋ค. Zymolyase์ฒ๋ฆฌ๋ฒ์ 5 mg/mL์ Zymolyase๋ฅผ 37โ์์ 30๋ถ๊ฐ ์ฒ๋ฆฌํ ํ, ์ธํฌ๋ฅผ PBS๋ก Washingํ๊ณ ์ธํฌ์ ๊ฐ ์ถ์ถ์ก์ 0.2 mL ์ฒจ๊ฐํ์ฌ 10๋ถ๊ฐ Incubationํ์ฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ์์ต๋๋ค. ์ ์ฒ๋ฆฌ ์์๊ณผ Pretreatment๋ ์ธํฌ์ ๊ฐ ์ถ์ถ์ก์ 0.2 mL ์ฒจ๊ฐํ์ฌ 10๋ถ๊ฐ Incubationํ์ฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ์์ต๋๋ค. Pretreatment๋ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ ์ ์ย WSE-7423 EzBactYeastCrusher์ ํฌํจ๋ Pre-Lysis buffer๋ฅผ ์ธํฌ์ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ 10๋ถ๊ฐ Incubationํ์์ต๋๋ค. Glass beads๋ฒ, Zymolyase๋ฒ์ ํฌํจํ์ฌย WSE-7423 EzBactYeastCrusher์์ ์ถ์ถํ lane(A)์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ๊ธฐํ ์ถ์ถ์์ฝ์ ๋นํด ๋จ๋ฐฑ์ง ๋ฐด๋๊ฐ ๋ง๊ณ , ๋๋๋ ๋์ ๊ฒ์ผ๋ก ๋ํ๋ฌ์ต๋๋ค. ํนํ, ์ฉ์ถ์ด ์ด๋ ค์ด ๊ณ ๋ถ์ ์์ญ์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ ํจ์จ์ด ๋๊ณ , ๋ค์ํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ด ๊ณ ํจ์จ๋ก ์ฉ์ถ๋ ์ ์์์ ์ ์ ์์ต๋๋ค.
์คํ์4: ํจ๋ชจ ์ถ์ถ ๋จ๋ฐฑ์ง์ Immunoprecipitation (๋ฉด์ญ์นจ๊ฐ)

A: Non-induced ํจ๋ชจ์ถ์ถ๋จ๋ฐฑ์ง๋ก IP
B: Induced ํจ๋ชจ์ถ์ถ๋จ๋ฐฑ์ง (with DTT)๋ก IP
C. Induced ํจ๋ชจ์ถ์ถ๋จ๋ฐฑ์ง (without DTT)๋ก IP

๊ทธ๋ฆผ์ V5 tag-EGFP ๋ฐํ ํจ๋ชจ์์ WSE-7423 EzBactYeastCrusher๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ ์ถ์ถํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ V5 ํญ์ฒด๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ ๋ฉด์ญ ์นจ๊ฐํ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ๋ํ๋ ๋๋ค. ์๋ ์ฌ์ง์ ์ถ์ถ ํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ Blue LEDํ์์ EGFP์ ํ๊ด์ ๊ฒ์ถํ ์ด๋ฏธ์ง์ ๋๋ค. ์ ๊ธฐ์๋ ํจํด์ ๋ ์ธA๋ ๋ฐํ ์ ๋ํ์ง ์์๊ธฐ ๋๋ฌธ์ EGFP ๋ฐด๋๋ ๊ฒ์ถ๋์ง ์์์ต๋๋ค. ๊ทธ๋ฌ๋ ๋ฐํ ์ ๋ํ ๋ ์ธ B์ C์๋ ๋ช ๋ฃํ๊ฒ EGFP ๋ฐด๋๊ฐ ๊ฒ์ถ๋์์ต๋๋ค. ๋ ์ธ B๋ ํ์์ ์ธ DTT๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ ์ํ์์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ์๊ธฐ ๋๋ฌธ์ ๋ฉด์ญ์นจ๊ฐ์์ ์ฌ์ฉํ ํญ์ฒด์ ๋ ๋ฐด๋๋ ํ์๋์ด Heavy chain(75kDa)๊ณผ Light chain(25kDa)์ผ๋ก ๋๋ฉ๋๋ค. ํํธ ๋ ์ธ A์ C๋ ํ์์ ๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ์ง ์๊ณ ์ถ์ถํ์ฌ ํญ์ฒด๊ฐ ํ์๋์ง ์๊ณ 150kDa ๋ฐด๋๋ก ๊ฒ์ถ๋์์ต๋๋ค. ์ด์ ๊ฐ์ด WSE-7423 EzBactYeastCrusher๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ ์ถ์ถํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ๋ณ์ฑ์ด ์ต์ํ์ผ๋ก ์ต์ ๋์ด ์์ด Antigen site-Antibody complex๊ฐ ์์๋์ง ์๊ณ ํ์ฑ์ ์ ์งํ ์ํ(EGFP์ ํ๊ด)์์ ์ ์ ์์ต๋๋ค.
ย 4. ๋๋ฌผ์ธํฌ์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ ๋ฐฉ๋ฒ
๋น๊ต์ ๋ถ๋๋ฌ์ด ์กฐ์ง์ ๊ฒฝ์ฐ Potterํ Homogenizer๊ฐ, ๋ํ ๋๋์ ์กฐ์ง์ ๋ค๋ฃจ๋ ๊ฒฝ์ฐ Waring Blender๋ Blender๊ฐ ์ด์ฉ๋๊ณ ์์ต๋๋ค. ๋ฌผ๋ก ๋ฏธ์๋ฌผ๊ณผ ๋ง์ฐฌ๊ฐ์ง๋ก ์ด์ํ ํ์๋ ๋๊ฒฐ ์ตํด๋ฒ์ ์ํ ํ์๋ ์ด์ฉ๋ฉ๋๋ค. ๋ ๋๋ฌผ ์ธํฌ์๋ ์ธํฌ๋ฒฝ์ด ์๊ธฐ ๋๋ฌธ์, ์ผํฌ์์ ์ํด ์ธํฌ๋ง์ ํ๊ดดํด ์๊ธฐ๊ด ๋ฑ์ ๋ถํํ๋ ๋ฐฉ๋ฒ์ด ์์ต๋๋ค. ์ด๋ค ์ข ๋ฅ์ ํจ์ ์ถ์ถ์๋ ์ ๊ธฐ์ฉ๋งค(์์ธํค)์ ์ํ ์ถ์ถ๋ฒ์ด ์ด์ฉ๋ฉ๋๋ค. ๊ทธ ์ธ ํจ์๋ ๊ณ๋ฉดํ์ฑ์ ๋ฅผ ์ด์ฉํ ์ถ์ถ๋ฐฉ๋ฒ๋ ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก ์์ฃผ ์ด์ฉ๋ฉ๋๋ค. ATTO์ WSE-7420 EzRIPA Lysis kit๋ Protease Inhibitor์ Phosphatase Inhibitor๊ฐ ํฌํจ๋์ด ์์ด ์ธํฌ์ ์๋ ๊ฒ๋ง์ผ๋ก ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์์ ์ ์ผ๋ก ์ถ์ถํ ์ ์์ต๋๋ค.
4-1. ์คํ๋ฐฉ๋ฒ
์คํ์ฌ๋ฃ
๋ฐฐ์์ธํฌ (10 cm dish, 5~20ร10โถ cells)
WSE-7420 EzRIPA Lysis kit
WSE-7430 EzPBS
๋ง์ดํฌ๋ก ์์ฌํ๋ธ, ํผํซ tip ๋ฑ
์์ฌ๊ธฐ, ๋ง์ดํฌ๋กํผํซ ๋ฑ

Cell culture
์ธํฌ๋ฅผ ์ ๋นํ ๋ฐฐ์ง์์ Confluentํ ๋๊น์ง ๋ฐฐ์ํฉ๋๋ค. (5~20ร10โถ cells ์๋น)
* ์ฌ์ฉํ๋ ์ธํฌ์ ๋ฐ๋ผ ์ธํฌ์ ํฌ๊ธฐ๋ ๋ฐ๋์ ๋ฐ๋ผ ํ์๋๋ ์ธํฌ ์๋ ๋ค๋ฆ
๋๋ค.
Washing
WSE-7430 EzPBS๋ก 2ํ ์ธ์ฒํฉ๋๋ค.
* WSE-7430 EzPBS๋ ์ฌ์ฉ์ ์ ์ฆ๋ฅ์๋ก 10๋ฐฐ ํฌ์ํฉ๋๋ค.
* Adherent cell์ ๋ผ์ด๋ด์ง ์๊ณ Washingํฉ๋๋ค. Suspension cell์ Microcentrifuge tube์ ์ง๊ท ํ์ฌ WSE-7430 EzPBS์ ํํํ์ฌ Washingํฉ๋๋ค.
* ์ธ์ ํ ์ธํฌ๋ -80โ์ ๋ณด๊ด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค.
์ธํฌ ์ฉํด
1.0 mL์ RIPA Lysis buffer๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ ice์ 15๋ถ๊ฐ ์ ์นํฉ๋๋ค.
* RIPA Lysis buffer์๋ ๋ฏธ๋ฆฌย WSE-7420 EzRIPA Lysis kit์ ํฌํจ๋ Protease Inhibitor์ Phosphatase Inhibitor๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํฉ๋๋ค.
* Suspension cell์ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ ์ RIPA Lysis buffer (์กฐ์ ์๋ฃ)๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ Pipetting์ผ๋ก ํ์ด์ค ํ, ice์ 15๋ถ๊ฐ ์ ์นํฉ๋๋ค.
์ถ์ถ์ก ํ์
์ธํฌ๋ฅผ Scraper ๋ฑ์ผ๋ก ๊ธ์ด๋ด์ด Microcentrifuge tube์ ํ์ํฉ๋๋ค. ์ด ์ธํฌ ์ถ์ถ์ก์ 15,000รg
์ธํฌ๋ฅผ ์คํฌ๋ ์ดํผ ๋ฑ์ผ๋ก ๊ธ์ด๋ด์ด ๋ง์ดํฌ๋ก ์์ฌ ํ๋ธ๋ก ํ์ํฉ๋๋ค.์ด ์ธํฌ ์ถ์ถ์ก์ 4โ, 15,000xg์์ 5~15๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํฉ๋๋ค.
* Suspension cell๋ ์์ ๋ง์ฐฌ๊ฐ์ง๋ก ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํฉ๋๋ค.
๋จ๋ฐฑ์ง ํ์
์๋ฑ์ก์ ์๋ก์ด Microcentrifuge tube๋ก ๋ชจ์์ค๋๋ค. ๊ฐ์ฉํ๋ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ฉ์ก์ ์ฌ์ฉ์๊น์ง ice์์ ๋ณด๊ด ๋๋ -80โ์์ ๋ณด๊ดํฉ๋๋ค.
* ํต๋จ๋ฐฑ์ง๋ ์ถ์ถํ๋ ๊ฒฝ์ฐ๋ SDS๋ฅผ ์ต์ข
๋๋๊ฐ 0.5%๊ฐ ๋๋๋ก ์ฒจ๊ฐํ๋ฉด ์ถ์ถํจ์จ์ด ๋์์ง๋๋ค. DNA ์ฉ์ถ๋ก ์ธํด ์ ์ฑ์ด ๋์์ง๋ฏ๋ก ์ด์ํ ํ์ ๋๋ DNase I๋ฅผ ์ฒ๋ฆฌํฉ๋๋ค.
์ผ๋ฐ์ ์ธ ๋๋ฌผ์ธํฌ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ๋ฐฉ๋ฒ
๋๋ฌผ์กฐ์งยท์ธํฌ๋ก๋ถํฐ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ๊ธฐ ์ํด์๋ ์ธํฌ๋ฅผ ํ์ํด์ผ ํฉ๋๋ค. ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก ์ํ์ ํ๊ดดํ๋ ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก๋ โ ๋ฌผ๋ฆฌ์ ํ์ (์ฉ๋งค๋ฅผ ์ํ์ 3~10๋ฐฐ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ ๊ท ์งํ๋ค), โก ์ด์ํํ์(50 mg/mL ์ดํ์ ๋๋๋ก ๋๊ฐํ๋ฉด์ 1~10๋ถ๊ฐ ์ด์ํ๋ฅผ ๊ฐํ๋ค), โข ๋๊ฒฐ์ตํด, โฃ ๊ฐ์ํ์ (French press ๋ฑ), โค ์ผํฌ์์ผํฌ (pH, ์ด์จ๊ฐ๋ ๋ณํ), โฅ ์ ๊ธฐ์ฉ๋งค (์์ธํค, ์์ฝ์ฌ์ ์ํด ์ง์ง๋ง ๊ตฌ์กฐ ํ๊ดด), โฆ ํจ์์ฒ๋ฆฌ (์ธํฌ๋ฒฝ์ ํจ์ ํ๊ดด ๋ฑ), โง ๊ณ๋ฉดํ์ฑ์ ์ด์ฉ ๋ฑ์ ๋ค ์ ์์ต๋๋ค.
ย 5. ์ธํฌ์๊ธฐ๊ด์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ ๋ฐฉ๋ฒ
์ธํฌ ๋ด์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ธํฌ์ง๊ณผ ํต, ๋ฏธํ ์ฝ๋๋ฆฌ์ ๋ฑ ์ด๋ค ํน์ ์์ญ์ ๋ถํฌํ๋ ๋จ๋ฐฑ์ง์ด ์์ต๋๋ค. ์ด ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์๊ทน์ด๋ ์ธํฌ์ฃผ๊ธฐ ๋ฑ์ ์ํฅ์ ๋ฐ์ ์์น๋ ๊ธฐ๋ฅ์ด ๋ณํํ๋ ๊ฒฝ์ฐ๊ฐ ์์ต๋๋ค. ์ธํฌ ์ ์ฒด์๋ ๋งค์ฐ ๋ง์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ด ์กด์ฌํ๋ฏ๋ก Target protein์ identification์ด๋ ๋ถ๋ฆฌ, ์ ์ ๊ฐ ์ด๋ ค์ด ๊ฒฝ์ฐ๊ฐ ์์ต๋๋ค. ์ด๋ฐ ๊ฒฝ์ฐ ์ธํฌ๋ฅผ ์ธํฌ์๊ธฐ๊ด๋ณ๋ก ๋๋์ด ํด์ํจ์ผ๋ก์จ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ ์ ์์ด Target protein์ ๋์ ์ด๋ ๊ธฐ๋ฅ ํด์์ ๋ณด๋ค ๊ฐ๋จํ๊ฒ ํ ์ ์๊ฒ ๋ฉ๋๋ค.์ํ ์ WSE-7421 EzSubcell Extract๋ Protease Inhibitor์ DNase I์ด ํฌํจ๋์ด ์์ด ์ธํฌ์ ์๋ ๊ฒ๋ง์ผ๋ก ์ธํฌ์ง ๋ถํ, ํต๋ถํ, ๋ฏธํ ์ฝ๋๋ฆฌ์๋ฑ์ ๋ง๋ถํ, ๋ถ์ฉ์ฑ ๋ถํ ๊ฐ๊ฐ์ ๋ถ๋ฆฌยท์ถ์ถ ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค.
5-1. ์คํ๋ฐฉ๋ฒ
์คํ์ฌ๋ฃ
๋ฐฐ์์ธํฌ (10 cm dish, 5~20ร10โถ cells)
WSE-7421 EzSubcell Extract
WSE-7430 EzPBS
๋ง์ดํฌ๋ก ์์ฌํ๋ธ, ํผํซ tip ๋ฑ
์์ฌ๊ธฐ, ๋ง์ดํฌ๋กํผํซ ๋ฑ

Cell culture
์ธํฌ๋ฅผ ์ ๋นํ ๋ฐฐ์ง์์ Confluentํ ๋๊น์ง ๋ฐฐ์ํฉ๋๋ค. (5~20ร10โถ cells ์๋น)
* ์ฌ์ฉํ๋ ๋ฐฐ์ง์ ๋ฐ๋ผ ์ธํฌ์ ํฌ๊ธฐ๋ ๋ฐ๋์ ๋ฐ๋ผ ํ์๋๋ ์ธํฌ ์๋ ๋ค๋ฆ
๋๋ค.
์ธํฌ ํ์
์ธํฌ๋ฅผ WSE-7430 EzPBS๋ก Washingํ๊ณ Trypsin ๋ฑ์ผ๋ก Detachํ์ฌ ํ์ํฉ๋๋ค. ํ์ ํ ์ธํฌ๋ ๋ค์ WSE-7430 EzPBS๋ก Washingํฉ๋๋ค.
* ๋ฌผ๋ฆฌ์ ํ๊ดด๋ฅผ ํผํ๊ธฐ ์ํด Scraper ๋ฑ์ผ๋ก ๋ผ์ด๋ด์ง ์๊ณ ์ธํฌ๋ Dissociationํ์ฌ ํ์ํฉ๋๋ค.
* WSE-7430 EzPBS๋ ์ฌ์ฉ ์ ์ ์ฆ๋ฅ์๋ก 10๋ฐฐ ํฌ์ํฉ๋๋ค.
* Suspension cell์ Microcentrifuge tube์ ์ง๊ท ํ์ฌ WSE-7430 EzPBS์ ํํํ์ฌ Washingํฉ๋๋ค. Washing ํ ์ธํฌ๋ -80โ์์ ๋ณด๊ด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค. ๋๊ฒฐ ํ ์ธํฌ์์๋ ์ถ์ถ ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค.
์ธํฌ์ง ์ถ์ถ
์ธํฌ์ ice์์ ์ฐจ๊ฐ๊ฒ ํ 1 mL์ Extraction buffer 1์ ์ฒจ๊ฐํ ํ, vortex๋ก ํผํฉํ์ฌ 4โ์์ 10๋ถ๊ฐ incubationํฉ๋๋ค. 4โ, 700รg์์ 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ Microcentrifuge tube์ ํ์ํฉ๋๋ค. (์ธํฌ์ง ๋ถํ)
์ธํฌ๋ง ์ถ์ถ
Pellet์ ice์์ ์ฐจ๊ฐ๊ฒ ํ 1 mL์ Extraction buffer 2๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ ํ, vortex๋ก ํผํฉํ์ฌย 4โ์์ 30๋ถ๊ฐ incubationํฉ๋๋ค.ย 4โ, 4,000รg์์ 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ Microcentrifuge tube์ ํ์ํฉ๋๋ค. (์ธํฌ๋ง ๋ถํ)
* ์ธํฌ๋ง ๋ถํ์๋ ๋ฏธํ ์ฝ๋๋ฆฌ์, ๊ณจ์ง์ฒด, ์ํฌ์ฒด ๋ฑ์ด ํฌํจ๋ฉ๋๋ค.
์ธํฌํต ์ถ์ถ
Pellet์ ice์ ์ฐจ๊ฐ๊ฒ ํ 0.5 mL์ Extraction buffer 3์ ์ฒจ๊ฐํ ํ, vortex๋ก ํผํฉํ์ฌย 4โ์์ 60๋ถ๊ฐ incubationํฉ๋๋ค.ย 4โ, 9,000รg์์ 5๋ถ๊ฐ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ Microcentrifuge tube์ ํ์ํฉ๋๋ค. (ํต ๋ถํ)
Insoluble ์ถ์ถ
Pellet์ ์์จ์ 0.5 mL์ Extraction buffer 4๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ vortexํ์ฌ ์ฉํดํฉ๋๋ค.
5-2. ์ฐธ๊ณ ๋ฐ์ดํฐ

์ธ๊ฐ ๊ฒฐ์ฅ์ ์ ๋ ์ธํฌ SW480(2ร10โท cells)๋ฅผ WSE-7420 EzRIPA Lysis kit ๋ฐ WSE-7421 EzSubcell Extract๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ ์ ์ธํฌ (Whole cell), ์ธํฌ์ง ๋ถํ(Cytosol, Ext.1), ์ธํฌ๋ง ๋ถํ(Membrane, Ext.2), ์ธํฌํต ๋ถํ(Nuclei, Ext.3), Insoluble ๋ถํ(Insoluble, Ext.4)์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ์ฌ AE-1430 EzApply๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์ ๊ธฐ์๋ ์ํ์ ์ค๋นํ์์ต๋๋ค. e-PAGEL (5-20% Gradient gel)๋ก ๋ถ๋ฆฌํ๊ณ AE-1465 EzFastBlot์ ์ฌ์ฉํ์ฌ ClearBlot P plus Membrane์ ์ ์ฌํ์ฌ AE-1477 EzBlock CAS๋ก 30๋ถ๊ฐ Blockingํ์์ต๋๋ค. Blocking ํ Membrane์ Mitochondria ๋ง์ปค์ Cytochrome Cํญ์ฒด, ์ด์ด์ HRPํ์ง 2์ฐจํญ์ฒด์ ๋ฐ์ํ์ฌ WSE-7120 EzWestLumi plus์์ ๊ฒ์ถํ์์ต๋๋ค. (๊ทธ๋ฆผ์ ์ฒซ๋ฒ์งธ ์ด๋ฏธ์ง) Whole cell ์ถ์ถ์ก๊ณผ ์ธํฌ๋ง ๋ถํ์์๋ง ๋ฐด๋๊ฐ ๊ฒ์ถ๋์ด, Mitochondria๋ฅผ ํฌํจํ ์ธํฌ๋ง ๋ถํ์ด ๋ค๋ฅธ ์๊ธฐ๊ด์ ์ค์ผ์์ด ๋ถ๋ฆฌ๋ ๊ฒ์ด ๋ํ๋ฌ์ต๋๋ค.
์ด Membrane์ WSE-7240 EzReprobe๋ก ํญ์ฒด๋ฅผ Strippingํ ํ, ๋ค์ย AE-1477 EzBlock CAS๋ก Blocking ํ, ์ธํฌํต ๋ง์ปค์ Lamin A/C ํญ์ฒด, ์ด์ด์ HRPํ์ง 2์ฐจํญ์ฒด์ ๋ฐ์ํ์ฌย WSE-7120 EzWestLumi plus๋ก ๊ฒ์ถํ์์ต๋๋ค. (๊ทธ๋ฆผ์ ๋๋ฒ์งธ ์ด๋ฏธ์ง) Whole cell๊ณผ ์ธํฌํต ๋ถํ์์๋ง ๋ฐด๋๊ฐ ๊ฒ์ถ๋์ด ์ธํฌํต ๋ถํ ๋ํ ๋ค๋ฅธ ์๊ธฐ๊ด์ ์ค์ผ์์ด ๋ถ๋ฆฌ๋ ๊ฒ์ ์ ์ ์์ต๋๋ค.
๋ค์ ๋์ผํ๊ฒ Stripping, Blocking์ ํ ํ,ย ฮฒ-Actinํญ์ฒด์ ๋ฐ์ํ์ฌ ๊ฒ์ถํ์์ต๋๋ค. (๊ทธ๋ฆผ์ ์ธ๋ฒ์งธ ์ด๋ฏธ์ง) ์ด Membrane์ Stripping, Blockingํ ํ, GAPDHํญ์ฒด์ ๋ฐ์ํ์ฌ ๊ฒ์ถํ์์ต๋๋ค. (๊ทธ๋ฆผ์ ๋ค๋ฒ์งธ ์ด๋ฏธ์ง)
์ธํฌ์ง ๋ง์ปค์ธย ฮฒ-Actin๊ณผ GAPDH๋ Whole cell์ถ์ถ์ก๊ณผ ์ธํฌ์ง ๋ถํ์ ๋ฐด๋๊ฐ ๊ฒ์ถ๋์์ง๋ง, ์ธํฌ๋ง ๋ถํ์๋ ๊ฒ์ถ๋๊ณ ์์ด์ ์ธํฌ์ง ๋ถํ์ด ๋ง ๋ถํ์ ์ฝ๊ฐ ํผ์ฌํ๊ณ ์๋ ๊ฒ์ด ๋ํ๋ฌ์ต๋๋ค. ์ด๋ฌํ ๊ฒฝ์ฐ,ย WSE-7421 EzSubcell Extract์ ์ํ ์๊ธฐ๊ด ๋ถํ์ ์ถ์ถ๋ฒ์ ์ถ์ถ์๋ง๋ค Washing์กฐ์์ ์ค์ํ์ฌ ์ค์ผ์ ์ค์ด๊ณ ์๊ธฐ๊ด ๋ถํ์ ์ถ์ถํ๋ ๊ฒ์ด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค. ์ด์ ๊ฐ์ดย WSE-7421 EzSubcell Extract๋ ๊ฐ ์๊ธฐ๊ด ๋ถํ์ ์ธํฌ์ ์๋ ๊ฒ๋ง์ผ๋ก๋ ์ถ์ถ์ด ๊ฐ๋ฅํ์ฌย WSE-7240 EzReprobe์ ํจ๊ป ์ฌ์ฉํ๋ฉด ์ ์ ์์ ์ํ๋ก ๋ง์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ๋ฐํ์ ์ ์ ์์ต๋๋ค.
์คํ์6: ์ถ์ถ์ก์ ๋จ๋ฐฑ์ง๋๊ณผ ํต ์ผ์ ์ด๋ฏธ์ง

Confluent๋ 1๊ฐ์ culture dish (ฯ100 mm, 1~2ร10โทcells)๋ฅผย WSE-7421 EzSubcell Extract๋ก ๊ฐ ์ธํฌ์ ์๊ธฐ๊ด ์ถ์ถ์ก์ ์กฐ์ ํ์์ต๋๋ค. Whole cell์ ์ถ์ถ์ก์ WSE-7420 EzRIPA Lysis kit๋ก ์กฐ์ ํ์์ต๋๋ค. ๋จ๋ฐฑ์ง ๋๋๋ BCA๋ฒ์ ์ด์ฉํ์์ต๋๋ค.

WSE-7421 EzSubcell Extract์ Extraction buffer 2๋ฅผ ์ฒ๋ฆฌํ ํ Pellet์ Trypan blue๋ก ์ผ์ํ์ฌ ๊ด์ฐฐํ ๊ฒ์ ๋๋ค. ํต ํ์์ ์ด์์ด ์์ด, ํต๋ง์ด ์ ์ง๋ ์ํ๋ก ๋ถ๋ฆฌ๋ ๊ฒ์ ์ ์ ์์ต๋๋ค. ๋๊ฒฐ๋ณด์กดํ ์ธํฌ์์๋ ๋ง์ฐฌ๊ฐ์ง๋ก ํต ๋ฐ ๊ฐ ์๊ธฐ๊ด์ ์ถ์ถ์ก์ ๋ถ๋ฆฌํ ์ ์์ต๋๋ค.
ย Related Products
๋์ฅ๊ท , ํจ๋ชจ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ Kit
WSE-7423 EzBactYeast Crusher
๋์ฅ๊ท ๋ฐ ํจ๋ชจ์ ํผํฉํ๋ ๊ฒ๋ง์ผ๋ก ์ฝ๊ฒ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ถ์ถํ ์ ์๋ Buffer์
๋๋ค. ์ถ์ถํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ์ , Immunoprecipitation, ํจ์ํ์ฑ ์ธก์ , Western blotting ๋ฑ์ ์ฌ์ฉ์ด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค.
ํคํธ ๊ตฌ์ฑํ: Yeast PreLysis buffer 100 mL, BactYeastLysis buffer 100 mL, DNase I 1 mL, Protease Inhibitor 1 mL
๋๋ฌผ์ธํฌ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ Kit
WSE-7420 EzRIPA Lysis kit
๋๋ฌผ์ธํฌ์์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ์ ๊ฐ์ฅ ๋ง์ด ์ฌ์ฉ๋๋ RIPA buffer์
๋๋ค. ์์ ๋์ผํ๊ฒ ๋ค์ํ ์ฉ๋๋ก ์ฌ์ฉ์ด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค.
ํคํธ ๊ตฌ์ฑํ: EzRIPA Lysis buffer 100 mL, Protease Inhibitor 1 mL, Phoshatase Inhihditor 1 mL
๋๋ฌผ์ธํฌ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ Kit (์ธํฌ ์๊ธฐ๊ด ๋ถ๋ฆฌ์ฉ)
WSE-7421 EzSubcell Extract
๋๋ฌผ์ธํฌ์ ํผํฉํ๋ ๊ฒ๋ง์ผ๋ก ๊ฐ ์๊ธฐ๊ด์ ๋จ๋ฐฑ์ง (์ธํฌ์ง, ๋ง, ํต, Insoluble)์ ๋ถ๋ฆฌ, ์ถ์ถํ ์ ์๋ Kit์
๋๋ค. ์ถ์ถํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์๊ธฐ์ ๋์ผํ๊ฒ ๋ค์ํ ์ฉ๋๋ก ์ฌ์ฉ์ด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค.
ํคํธ ๊ตฌ์ฑํ: Extraction buffer 50/25 mL (4์ข
), DNase 0.25 mL, Protease Inhibitor 1.25 mL
๋๋ฌผ์ธํฌ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ถ์ถ Kit (ํต, ๋ฏธํ ์ฝ๋๋ฆฌ์, ์ธํฌ์ง ๋ถํ์ฉ)
WSE-7422 EzSubcell Fraction
๋๋ฌผ์ธํฌ์ ํผํฉํ๋ ๊ฒ๋ง์ผ๋ก ํต, ๋ฏธํ ์ฝ๋๋ฆฌ์, ์ธํฌ์ง๋ก ๋ถํํ ์ ์๋ Kit์
๋๋ค. ์ถ์ถํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์์ ๋์ผํ๊ฒ ๋ค์ํ ์ฉ๋๋ก ์ฌ์ฉ์ด ๊ฐ๋ฅํฉ๋๋ค.
ํคํธ ๊ตฌ์ฑํ: Fraction buffer 50 mL (2์ข
), RIPA Lysis buffer 20 mL, Detergent mix 1 mL, Protease Inhibitor 0.7 mL
Phosphate buffer
WSE-7430 EzPBS
์ธํฌ ์ค๋น์์ ์ฌ์ฉํ๋ ์ผ๋ฐ์ ์ธ PBS Buffer์ 10๋ฐฐ ๋์ถ์ฉ์ก์ ๋๋ค.
Tips for Electrophoresis
- Basic operation of SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
- Method for extracting protein from tissue or cell
- Sample preparation for electrophoresis
- Preparation of polyacrylamide gel
- Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
- Principles and method of the 2-dimensional electrophoresis
- Protein electrophoresis gel staining
- Agarose gel electrophoresis (horizontal electrophoresis)
- How to choose the power supply