Principles and method of the 2-dimensional electrophoresis

MSDS

Principles

2-dimensional electrophoresis는 단백질을 2차원, 즉 X방향과 Y방향으로 2회 전기영동하는 분리방법입니다. 이 때 1차 전기영동, 2차 전기영동은 다른 분리 조건 (시료과 전기영동 조건)을 편성하여, 분리 능력을 뛰어나게 합니다. 그리하여 1장의 겔에 X방향으로 분리, 전개 + Y방향으로 분리, 전개 결과를 얻을 수 있습니다. 일반적으로는 1차원 전기영동 (X방향으로 분리)은 각 시료의 등전점에 의해서 분리 (IEF, IsoElectric Focusing)하고 2차원 전기영동 (Y방향으로 분리)은 각 시료의 분자량에 의해서 분리 (SDS-PAGE)합니다.

등전점 전기영동 (IEF)

단백질 펩타이드를 구성하는 아미노산은 아미노기 (-NH₂), 카르복실기 (-COOH) 등을 가진 양쪽성 전해질때문에 용해하고 있는 액체의 pH에 의한 전하의 크기와 극성이 변화합니다. 그래서 pH구배 중에 전기영동을 하면 각 단백질은 고유 전하에 따라 음극 (-) 양극 (+)에 이끌려 이동하지만 등전점에 이르는 전하가 0이면 이동하지 않게 됩니다. 이처럼 각 단백질 펩타이드 고유의 등전점을 이용하고 분리하는 방법을 등전점전기영동이라고 합니다. 겔(지지체)은 Agarose나 Polyacrylamide가 이용되며, 2차원 전기영동 Gel의 위에 1차원 전기영동 Gel을 올리기 위해 원기둥이나 직사각형 모양의 Gel을 사용합니다.

SDS-PAGE

단백질과 펩타이드는 구성 아미노산과 녹아 있는 완충 용액의 pH에 의해서 (+)에도 (-)에도 하전되기 때문에 SDS (음이온성 계면활성제)를 단백질에 결합시키고 단백질을 일시적으로 (-)로 하전시켜 (+) 쪽으로 이동시킵니다. 이 때 단백질은 평판 형태의 Polyacrylamide gel 내에서 Gel의 분자 체 효과로 분자량에 따른 이동도를 나타내며 분리됩니다.

Sample preparation

시료를 충분히 용해하는 것이 중요합니다. 원심분리를 하여 불용물질을 최대한 제거합니다.

1차원은 등전점 전기영동이므로 시료 용액중에는 가급적 시료 (단백질과 polypeptide) 이외의 것이 존재하지 않는 것이 좋습니다. 염이나 극성을 가진 계면활성제 등은 포함되지 않도록 합니다. 극단적인 pH도 좋지 않습니다. 시료가 수용성의 경우는 그다지 문제가 되지 않지만, 불용성인 경우에는 비이온성 또는 양성의 계면활성제나 요소 등으로 용해도를 높입니다.