Preparation of polyacrylamide gel

  1. 개요

전기영동은 단백질 고유의 전하나 분자량의 차이를 이용하여 전기로 각 분자를 분리하는 방법입니다. 가장 많이 사용되는 SDS-PAGE (SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis)는 단백질에 SDS를 부가하여 음극으로 대전시키고 acrylamide gel의 mesh구조를 이용하여 단백질을 분자량의 차이로 분리합니다.
ATTO의 제품을 사용하여 Polyacrylamide gel의 제작 방법에 대해 알아보겠습니다.

  2. 제작 과정

1. Plate setting
필요한 gel 매수에 따라 Dual Mini Gel Cast 또는 Multi Mini-Slab Gel Cast를 조립합니다.
* Gel Caster
AE-6401 1 mm Dual Mini Gel Cast, WSE-1190 Multi Mini-Slab Gel Cast, etc.

2. Gel solution preparation
Gel 조제에 필요한 시약을 준비합니다. Gel solution은 제작 직전에 혼합합니다. Target protein의 크기에 따라서 acrylamide의 농도를 변경합니다.
* Gel buffer
WSE-7310 EzGel Ace, WSE-7150 EzGel Sep, WSE-7155 EzGel Stack, etc.

3. 전기영동
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis로 단백질을 분리합니다. 목적하는 단백질에 따라 샘플의 조제방법, Running buffer를 선택합니다.
* Gel, Running buffer
e-PAGEL, AE-1410 EzRun, etc.
* 사용하는 제품 (전기영동장치, power supply)
WSE-1165 Mini-Slab, WSE-3400 myPower H300, etc.

  3. 제작 방법

3-1. 기기, 재료 및 Stock solution

– WSE-7310 EzGel Ace, WSE-7150 EzGel Sep, WSE-7155 EzGel Stack, etc. (Gel buffer)
– Acrylamide/bis solution (acrylamide monomer)
– Ammonium persulfate (APS, polymerization initiator)
– N,N,N’,N’,-Tetramethylethylenediamine (TEMED, polymerization accelerator)
– Distilled water
– Gel caster / Multiple gel caster
– Gel plate
– Comb
– Spacer

< Stock solution 제작 >
(A) Acryamide/bis solution
Acrylamide/bis solution은 분획분자량 범위에 따라 19:1, 29:1, 37.5:1 등의 crosslinker 비율 용액이 사용됩니다. Crosslinker 비율이 높은 용액일수록 저분자량을, crosslinker 비율이 낮을수록 고분자량을 분획하는 범위가 넓어집니다.

• 30(w/v)% Acrylamide/bis (29:1) solution
  29 g의 acrylamide와 1 g의 N,N’-Methylenebisacrylamide를 50 mL의 증류수에 용해합니다. 용해 후 증류수를 가해 100 mL로 맞춥니다.

(B) Gel buffer

• WSE-7310 EzGel Ace
  중성의 gel buffer로 stacking gel 및 separating gel에 사용이 가능합니다. 제작한 gel은 장기 냉장보관이 가능합니다. (약 1개월)
• WSE-7155 EzGel Stack
  Laemmli method에 따른 stacking gel buffer입니다. 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)에 대응되는 buffer입니다.
• WSE-7150 EzGel Sep
  Laemmli method에 따른 separating gel buffer입니다. 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)에 대응되는 buffer입니다.

* Gel buffer는 WSE-7310 EzGel Ace 단독으로 사용하거나, WSE-7155 EzGel Stack, WSE-7150 EzGel Sep의 조합으로 사용해주십시오.

(C) 10% APS (Ammonium persulfate)
0.1 g의 APS를 칭량하여 1 mL의 증류수에 용해합니다.
* 10% APS는 서서히 활성이 떨어지므로 필요시 조제하는 것을 권장합니다. 냉장상태에서 1주일 정도 보관이 가능합니다.

(D) TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine)
원액을 그대로 사용합니다.

주요 전기영동 시약의 조성
전기영동에 사용하는 주요 시약의 조성입니다. 보다 재현성이 좋고 간편하게 실험할 때에는 e-PAGEL 등 precast gel이나 ATTO reagents를 이용하십시오.

3-2. Plate 조립 (AE-6401 1 mm Dual Mini Gel Cast)

ATTO의 AE-6401 1 mm Dual Mini Gel Cast를 이용하여 gel을 제작하는 방법을 소개합니다.

3-3. Plate 조립 (WSE-1190 Multi Mini-Slab Gel Cast)

ATTO의 WSE-1190 Multi Mini-Slab Gel Cast를 이용하여 gel을 제작하는 방법을 소개합니다.

  4. 참고 데이터

실험예1. Acrylamide 농도와 Running buffer의 영향

위 그림은 molecular weight marker를 다양한 acrylamide 농도의 PAGE gel과 running buffer에서 전기영동한 결과입니다.
7.5% gel을 이용하여 분리한 결과를 보면, AE-1440 EzStandard (각 gel의 우측 2개 lane)의 패턴이 AE-1410 EzRun에서는 3개의 밴드가 검출된 반면, WSE-7065 EzRun MOPS에서는 6개의 밴드가 검출되었습니다. 이와 같이 WSE-7065 EzRun MOPS를 사용할 경우, 저분자 단백질의 분리 범위가 넓어집니다.

실험예2. Gel buffer와 precast gel의 비교

위 사진은 molecular weight marker를 10% acrylamide 농도의 polyacrylamide gel을 사용하여 분리한 결과입니다.
왼쪽의 두 gel은 WSE-7310 EzGel Ace를 사용하여 제작한 gel을 WSE-7065 EzRun MOPS,  AE-1410 EzRun을 각각 사용하여 전기영동한 결과입니다. 가장 오른쪽의 gel은 WSE-7155 EzGel Stack, WSE-7150 EzGel Sep를 이용하여 직접 제작한 gel의 전기영동 결과입니다.
e-PAGEL은 10% e-PAGEL (precast gel)을 사용한 전기영동 결과입니다.
Gel buffer에 따라서 같은 acrylamide 농도의 gel이라도 이동도에 차이가 나는 것을 알 수 있습니다. 또한, 실험예1.에서도 알 수 있듯이 running buffer가 다르면 단백질의 이동도가 달라져, WSE-7065 EzRun MOPS를 사용하면 저분자 단백질이 보다 명확하게 분리될 수 있습니다. 
즉, running buffer를 WSE-7065 EzRun MOPS로 바꾸는 것만으로도 10%의 gel이 마치 gradient gel과 유사한 밴드 패턴을 나타내게 됩니다. 이처럼 동일한 acrylamide 농도의 gel을 사용하더라도 gel buffer와 running buffer에 따라서 단백질의 분리 범위와 이동도는 영향을 받습니다.

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