042-822-1117 info@attokorea.co.kr

Protein electrophoresis gel staining

  1. 개요

전기영동은 단백질 고유의 전하나 분자량의 차이를 이용하여 전기로 각 분자를 분리하는 방법입니다. 일반적으로 acrylamide 등으로 이루어진 투명한 gel을 사용하여 단백질을 크기에 따라서 분리하지만, 그대로는 밴드를 확인할 수 없습니다. 이에 Coomassie Brilliant Blue 등의 색소염색이나 silver staining 등으로 밴드를 시각화하고 분자량의 예측이나 발현량을 비교합니다.
ATTO의 제품을 사용한 gel staining에 대해 알아보겠습니다.

  2. Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining

CBB staining은 저렴하고 간편한 방법이며, 정량적으로 염색되기 때문에 가장 많이 사용되는 gel staining method 중 하나입니다. 검출 한계는 10 ~ 100 ng/band입니다. 염색원리는 색소와 단백질 아미노기가 전기적으로 결합하거나 비공유적으로 반데르발스힘에 의해 상호작용하기 때문이라고 알려져있습니다. ATTO의 AE-1340 EzStain AQua는 alcohol이나 acetic acid를 사용하지 않고, 탈색시에는 DW를 사용할 수 있어 간편하고 친환경적인 staining 방법입니다. 검출 감도도 일반적인 CBB staining method에 비해 3~5배 높으며 밴드 이외의 부분이 염색이 잘 되지 않기 때문에 단시간에 단백질 band를 확인할 수 있습니다.

2-1. 실험 방법

실험재료
전기영동한 gel, AE-1340 EzStain AQua
증류수, 용기, 전자레인지 등

1. AE-1340 EzStain AQua로 염색하는 경우, 목적단백질의 밴드가 수십 ng이상이 되도록 loading 하는 단백질을조절합니다. 전기영동 후의 gel은 방치하지말고 바로 staining solution에 침지합니다.
* 저분자를 staining할 경우, fixation solution (40% methanol, 10% acetic acid solution)으로 30분 이상 고정해주십시오.

2. AE-1340 EzStain AQua를 gel보다 약간 큰 tray에 붓고, 전기영동 후의 gel을 용액에 침지합니다. (~50 mL/gel) 실온에서 3시간 이상 staining합니다.
* 빠르게 염색하는 경우는 전자레인지에 30~60초 (약 40℃까지 가온)간 데웁니다. 실온에서 30분 이상 염색합니다.

3. AE-1340 EzStain AQua를 폐기하고 증류수로 2회 헹굽니다. 증류수를 첨가하여 destaining합니다. (~100 mL/gel)
* 빠르게 탈색하는 경우는 전자레인지에 30~60초 (약 40℃까지 가온)간 데웁니다. 실온에서 30분 이상 탈색합니다.

  3. Silver staining

Silver staining법은 chromogenic assay 중에서는 가장 감도높게 단백질을 염색하는 방법입니다. 일반적으로 검출 한계는 100 pg ~ 1 ng/band입니다. 검출 감도는 뛰어나지만 gel 표면의 단백질만 염색되고 금방 staining이 포화되기 때문에 정량성이 부족한 것으로 알려져있습니다. 단백질 고정에 glutaraldehyde를 사용하면 staining 도중에 단백질이 변형되기 때문에 질량 분석 등에 적합하지 않습니다. ATTO의 AE-1360 EzStain Silver는 시약 조제가 용이하며, 약 1시간 만에 staining이 완료되는 신속하고 간편한 방법입니다. DNA staining에도 사용할 수 있으며, 질량분석에도 적합한 staining 방법입니다.

3-1. 실험 방법

실험재료

  • 전기영동한 gel
  • AE-1360 EzStain Silver
  • Methanol
  • Acetic acid
  • 증류수
  • 마이크로피펫
  • 메스실린더
  • 용기, 등

1. 아래 4종류의 시약을 조제합니다.
S-1~4 용액은 AE-1360 EzStain Silver에 포함된 시약입니다. 발색액은 200 mL, 그 이외의 용액은 100 mL이 필요합니다.
고정액: 1% S-1 용액, 50% methanol, 10% acetic acid
염색액: 1% S-2 용액
발색액: 1% S-3 용액, 1% S-4 용액
정지액: 1% acetic acid

2. 전기영동이 끝난 gel을 고정액에 침지시키고 10분간 incubation합니다.
* AE-1360 EzStain Silver에서 검출할 경우에는 목적단백질 농도가 수백 pg/band 이상이 되도록 합니다.

3. 고정액을 폐기하고 증류수로 10분씩 2회 세척합니다.
* Sample buffer에 DTT가 첨가되어 있는 경우는, 증류수 대신 30% methanol로 세척합니다.

4. 증류수로 10분간 세척한 후 염색액을 첨가하고 5분간 incubation합니다.
* 염색액은 중금속 폐액으로 처리해주십시오. Gel이 두꺼울 경우 시간을 늘립니다.

5. 증류수로 가볍게 헹군 후 발색액을 1/2분량만 첨가하여 30초간 incubation합니다. 발색액을 폐기하고 나머지 발색액으로 교체하여 발색될 때까지 incubation합니다.
충분히 발색이 되면 정지액을 첨가하여 10분간 incubation하여 발색을 정지합니다. 그 후 증류수로 치환합니다.

  4. Reverse (Negative) staining

Reverse staining은 단백질 밴드는 투명한 상태로, 밴드 이외의 gel 부분 (background)이 하얗게 염색되는 검출 방법입니다. 검출 한계는 1~10 ng/band입니다. Gel 내의 SDS 등의 salt와 염색액 내의 금속이온이 결합하여 침전되므로 단백질 밴드 이외의 부분이 하얗게 변합니다. 단백질 자체는 염색의 영향을 거의 받지 않습니다.
ATTO의 AE-1310 EzStain Reverse는 시약 조제가 용이하며, 약 30분 만에 염색이 완료되는 신속하고 간편한 방법입니다. DNA 염색에도 사용할 수 있으며 질량분석에도 적합한 염색 방법입니다.

4-1. 실험 방법

실험재료

1. 아래 4종류의 시약을 조제합니다.

R-1, R-2 용액은 AE-1310 EzStain Reverse에 포함된 시약입니다.

전처리액: 10% methanol/100 mL
염색액: 10 mL R-1 용액 + 50 mL 증류수
발색액: 10 mL R-2 용액 + 50 mL 증류수

 2. 전기영동이 끝난 gel을 전처리액에 침지시키고 5분간 incubation합니다.

3. 증류수로 30초 동안 세척한 후 염색액을 첨가하여 10~15분간 incubation합니다.
* 염색액은 중금속 폐액으로 처리하십시오. Gel 농도가 높을 경우 염색 시간을 늘려줍니다.

4. 증류수로 30초 동안 세척한 후 발색액을 첨가하여 1~3분간 incubation합니다.
* 검은색 종이를 바닥에 두고 발색 과정을 진행하면 band를 확인하기 쉽습니다.

5. 발색액을 폐기하고 증류수를 첨가하여 2분씩 2회 incubation한 후 발색을 정지합니다.

  5. 참고 결과

실험예1. CBB 염색법의 비교

CBB solution comparison

위의 사진은 human transferrin 단백질을 400 ng/lane부터 1/2로 serial dilution한 샘플을 전기영동하여 AE-1340 EzStain AQua 및 일반적인 CBB solution으로 gel을 staining한 결과입니다.

AE-1340 EzStain AQua와 CBB solution은 전자레인지를 사용하면 빠르게 staining이 가능하며 (A, D) AE-1340 EzStain AQua은 10분 만에 밴드를 확인할 수 있습니다(A). AE-1340 EzStain AQua는 Overnight staining을 해도 band 이외의 부분이 상대적으로 staining 되지 않기 때문에 탈색없이도 밴드를 확인할 수 있습니다(B). 더욱이 destaining 후에는 일반적인 CBB staining법의 검출 한계가 25 ng/lane (F)인데 비해 AE-1340 EzStain AQua은 1/4 수준인 6.2 ng/lane까지 검출이 가능합니다(C). 이와 같이 AE-1340 EzStain AQua는 간편할 뿐 아니라, 빠르고 감도높은 band를 검출할 수 있는 CBB staining solution입니다.

실험예2. Running buffer의 차이

staining method comparison

위 사진은 human transferrin 단백질을 400 ng/lane부터 1/2 serial dilution한 샘플을 전기영동하여 ATTO의 gel staining solution으로 staining한 결과입니다.
WSE-7010 EzLabel FluoroNeo는 샘플 제조 시 형광표지를 하였으며 gel staining은 하지 않았습니다. 이처럼 동일한 조건으로 전기영동한 gel이더라도 gel의 staining 방법에 따라 검출 감도가 달라집니다.

  Related Products

WSE-1165 Mini-Slab

WSE-1165 Mini-Slab

 고속 전기영동이 가능한 전기영동장치
+, -극 구분이 필요없으며 다양한 precast gel 및 handcast gel 대응이 가능

WSE-3100 PowerStation Ghibli I

WSE-3100 PowerStation Ghibli I

터치패널형 power supply
대형 color display로, 직관적인 표시와 간단한 조작

WSE-5300 Printgraph CMOS I

WSE-5300 Printgraph CMOS I

6MP 고해상도의 CMOS 카메라 탑재
터치패널형 display로 조작이 간편한 Gel documentation system

WSE-6300 Luminograph III

WSE-6300 Luminograph III

고해상도 6MP CCD카메라와 초고감도 F0.8렌즈 탑재
터치패널형 Chemiluminesce imaging system

WSC-2400 SeesawShaker atto

WSC-2400 Seesawshaker atto

고르게 진동하는 메트로놈 방식의 shaker
Gel과 blotting membrane의 염색, 탈색 반응 시 용이