Chemiluminescence Imaging
1. Chemiluminescence (화학발광) Imaging
Western blotting이나 Southern blotting, Northern blotting의 검출에는 화학 반응에 의해서 발광하는 시약이 사용됩니다. 이 반응으로 발광하는 현상을 화학발광 (Chemiluminescnece)라고 부릅니다. Chemiluminescence Imaging이란 Blotting 후에 발광 검출을 화상으로 촬영하는 것을 의미하는 Imaging을 합친 것입니다.
아토에서는 Chemiluminescence Imaging용 장비로 cooling CCD camera system인 LuminoGraph series가 있습니다.
2. Chemiluminescence Imaging을 위한 “발광시약”
HRP용 발광 기질
Western blotting에서는 HRP (Horseradish Peroxidase)를 표지한 Secondary antibody를 Membrane상의 항원과 결합한 Primary antibody와 결합시킵니다. 그리고 Luminol과 과산화수소가 함유된 발광시약 (발광물질)을 첨가하여 검출합니다. 이 결합된 HRP 표지 Secondary antibody는 425 nm에서 최대파장의 빛을 냅니다.
이 방법은 발광시약을 첨가하자마자 강한 발광이 일어나므로 발광촬영 직전에 Membrane에 발광시약을 첨가하여 바로 촬영하는 것이 좋습니다. ATTO에는 Western blotting의 발광 검출에 사용되는 HRP용 발광 시약 2종이 있습니다.
ATTO의 Blotting 시약 및 소모품 – Detection solution for HRP (Chemiluminescence)
WSE-7110 EzWestLumiOne
WSE-7120 EzWestLumi plus
ALP용 발광 기질
Southern blotting, Northern blotting에서는 ALP (Alkaline Phosphatase)를 Probe에 직접 표지하거나 Biotin이나 DIG라고 하는 리간드를 개입시켜 표지하여, Dioxiethane계 발광 시약을 더해 발광 검출을 실시합니다. 이 때 Membrane 상의 ALP 표지 Probe가 결합된 Specific band에서는 Maximum wavelength 470 nm의 빛을 냅니다.
Southern blotting이나 Northern blotting에 사용되는 검출 Kit에는 ALP가 표지 효소로 많이 사용되고 있습니다. 이 검출방법은 발광시약을 첨가한 후 발광이 강해질 때까지 시간이 필요합니다. 37℃에서 5~15분 Incubation하거나, 실온에서 1시간 정도 Incubation하면 촬영에 적절한 강한 발광을 얻을 수 있습니다.
3. Chemiluminescence Imaging에 적합한 CCD
발광검출시약의 파장대 (420 nm ~ 500 nm)에서 감도가 높은 CCD
HRP와 ALP 발광시약은 425 nm ~ 500 nm 파장영역의 빛이 가장 강합니다. 이는 EtBr과 같은 형광검출 시약에 비해 동일한 가시광선 영역의 빛이라도 더 짧은 파장대의 빛입니다. Gel 촬영 장비에 사용하는 카메라도 일반 디지털카메라에 비하면 훨씬 고감도이지만, 발광 검출에는 감도가 부족합니다. 특히, 500 nm 이하의 빛에 감도가 높은 CCD가 요구됩니다.
ATTO의 Chemiluminescence Imaging System인 LuminoGraph series에서는 이 파장영역에서 감도가 높은 CCD를 사용하여, 발광촬영에 대응하고 있습니다.
고감도 CCD 카메라
발광검출시약의 파장대 (420 nm ~ 500 nm)에서 감도가 높은 CCD
높은 S/N ratio를 얻을 수 있도록 Noise가 적은 CCD
미약한 신호도 감지가 가능한 High-bit gray level
Chemiluminescence Imaging은 고감도 카메라를 사용하면 더욱 선명한 이미지를 단시간에 촬영하는 것이 가능합니다. 고감도 카메라는 발광 검출의 감도가 높은 CCD를 사용하고, 장시간의 노출에도 노이즈가 적고 높은 Gray level의 이미지가 가능해야 합니다.
ATTO의 Chemiluminescnece Imaging System인 LuminoGraph series의 카메라는 장시간 노출에도 Noise를 최소화하기 위해 냉각 CCD camera를 사용합니다. CCD를 냉각하여 Noise를 줄이는 것 뿐만 아니라, 일정한 온도에서 안정적으로 유지되는 것도 중요합니다. ATTO는 냉각용 Peltier 소자의 방열기구(강제 공랭식 2단 Peltier 냉각 방식)를 고안하여 장시간 안정된 냉각 상태를 유지할 수 있도록 하였습니다. 이 냉각 기능과 Noise data를 사용하여 고감도 촬영 이미지를 얻을 수 있습니다. 또한 이미지는 16-bit (65,536 bit) 데이터로 얻을 수 있기 때문에 미약한 발광을 검출도 가능합니다.
4. 최적의 정량 분석 데이터를 얻기 위해서
각 밴드가 하나씩 Sharp하게 분리되어 있다.
밴드가 유실되는 부분 없이 완전한 전기영동 패턴을 보인다.
발광 검출에서 Background가 적고 균일하다.
촬영한 Band의 Signal이 농도에 비례하여 높아진다.
Chemiluminescence를 촬영한 이미지는 정량 분석을 실시하고 각 Band간 농도 비교를 수행합니다. 분석 소프트웨어는 더욱 진화했지만 깨끗한 전기영동 패턴으로 비교하는 것이 분석 작업에 있어서 오류를 줄이고, 더욱 쉽게 분석이 가능합니다. 그 때문에 전기영동, Blotting, 항체 반응이나 Hybridization, 발광 검출의 모든 조작을 신중하게 하는 것이 분석을 용이하게 하는 지름길입니다.
ATTO에서는 전기영동이나 Blotting, 발광 검출에 관한 장치, 시약 및 실험의 Tip을 제공하고 있습니다. 아토코리아 홈페이지의 Technical Info를 참고해주시고, 아토 제품 사용 중의 문의사항과 Troubleshooting이 필요하시면 아토코리아로 문의주십시오.
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