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Gel Imaging (Nucleic Acid)

  1. Gel Imaging (Fluorescence)

Agarose gel 또는 Polyacrylamide gel 내의 핵산은 EtBr이나 GelGreen 등의 형광시약을 사용하여 검출합니다. 이 형광 검출을 화상으로 촬영하는 것을 Gel Imaging, 이 형광 검출을 시각화하고, 화상으로 촬영하는 장비를 Gel Documentation System이라고 부릅니다.
Gel Documentation System UV 광원, 외부 광원을 차단하고 UV 노출로부터 사용자를 보호하는 후드 또는 암실, 광원의 빛을 제거하고 형광검출된 파장의 빛만 걸러주는 Filter, 이미지 촬영을 위한 카메라로 구성되어 있습니다.
아토에서는 Gel Documentation System으로 Printgraph series가 있습니다.

  2. Gel Imaging을 위한 “형광시약”

DNA 전기영동의 경우, DNA, RNA의 검출을 위해서 Ethidium Bromide (EtBr) 또는 SYBR Green, SYBR Safe, GelRed 등의 형광시약을 사용합니다.
EtBr은 발암물질이므로 사용에 주의가 필요하기 때문에 최근에는 Safe dye라고 불리는 다양한 EtBr 대체시약들이 개발되었습니다.
형광시약은 넣는 방식에 따라서, Agarose gel 제작 시에 형광시약을 넣어서 제작하는 방법, Sample에 형광시약을 섞어서 Gel loading하는 방법, 전기영동 후의 gel을 염색시약을 희석한 용액에 담가서 염색하는 방법이 있습니다. 이는 각 시약의 매뉴얼에 따라 진행하도록 합니다.
이 시약들은 DNA, RNA와 결합하며, UV 등의 특정 파장대의 빛을 흡수하면 (Absorption) excitation(여기)되어 특정 파장대의 빛을 냅니다 (Emission).
사용하는 시약의 Absorption, Emission 파장을 알고 그에 맞는 광원과 필터를 선택해야 더욱 선명하고 깨끗한 고감도의 이미지를 얻을 수 있습니다.

Absorption and Emission wavelength of EtBr

예로 EtBr은 300 nm 부근의 UV 파장대와 520 nm 부근의 초록색 파장의 빛을 흡수합니다. 이 파장대의 빛을 쪼여주면 Excitation되어 600 nm 부근의 주황색 빛을 냅니다. EtBr은 UV에서 가장 고감도로 보이지만, 520 nm 부근의 초록색 파장의 빛도 흡수를 합니다. 다만 450 nm 부근의 파란색 빛은 흡수율이 낮아서 Blue LED 하에서는 확인이 거의 어렵습니다.
Emission 파장대는 600 nm 부근으로, 이 파장대의 필터를 사용하면 가장 고감도의 이미지를 얻을 수 있습니다.

Absorption and Emission wavelength of SYBR Safe

SYBR Safe의 경우, 280 nm 부근의 UV 파장대와 510 nm 부근의 초록색 파장의 빛을 흡수합니다. 이 파장대의 빛을 쪼여주면 Excitation되어 530 nm 부근의 초록색 빛을 냅니다.
SYBR Safe의 경우 530 nm 부근의 형광발광된 빛의 강도가 더 세므로, 595 nm 필터보다 535 nm 필터를 사용하면 더 짧은 exposure time에도 고감도의 이미지를 얻을 수 있습니다.

Comparison of DNA fluorescence dye-01

EtBr SYBR Safe의 이미지를 비교해보면, SYBR Safe UV보다 Cyan광원에서 동일시간 촬영했을 때 더욱 고감도의 이미지를 얻을 수 있습니다.
EtBr Cyan광원에서 확인이 가능하기는 하나, 위의 그래프에서처럼 UV 흡수율이 더 높기 때문에 Cyan보다는 UV에서 더 높은 감도의 이미지를 얻을 수 있습니다.

  3. 광원 (Light source)

Gel Imaging에는 일반적으로 UV광원을 사용합니다. 다만 UV DNA mutation을 유발하거나, 사람의 눈과 피부에 장시간 노출시 광각막염이나 화상을 유발할 수 있기 때문에 사용에 주의를 요합니다. 최근에는 Blue LED (470nm 부근)를 사용한 장비도 출시되고 있습니다. 다만, EtBr 및 일부 형광시약은 Blue LED 광원에서 Excitation되지 않아서 검출이 어려울 수 있기 때문에 사용하는 시약의 Absorption 파장을 확인해야 합니다. ATTO에서는 EtBr도 검출이 가능한 Cyan광원(505nm부근)옵션으로 범용성을 높였습니다.

 UVBlue LEDCyan LED
감도★★★★★★★★★★★
유지비용★★★★★★★★★★
범용성★★★★★★★★★★★★
안정성★★★★★★★★★★

  4. Filter

광원의 빛은 이미지에 함께 보이게 되면 Background가 높아져서 이미지의 품질이 떨어지므로 형광시약에서 내는 빛만 걸러주기 위해서 필터를 사용합니다.
ATTO 595nm bandpass filter, 535nm bandpass filter 또는 560nm longpass filter를 사용하여 광원의 파장을 걸러내고 다른 noise를 최소화하여 깨끗한 이미지를 얻을 수 있도록 하였습니다.

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해상도6백만6백만6백만150만
광원UVUVUV, Cyan, RedUV
Filter595 nm bandpass595 nm bandpass, 535 nm bandpass595 nm bandpass, 665 nm bandpass560 nm longpass
ControlTouch panelTouch panelTouch panelPC

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